摘要熒光/光聲成像和光療技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用引起了人們越來越多的關(guān)注，然而很多熒光/光聲造影劑存在生物相容性較差，缺乏腫瘤靶向性，信噪比較低，功能單一等共性問題，嚴(yán)重限制其診療應(yīng)用。透明質(zhì)酸具有優(yōu)異的生物相容性和主動(dòng)腫瘤靶向性，可被透明質(zhì)酸酶降解，并且易于化學(xué)修飾和實(shí)現(xiàn)多種超分子弱相互作用力協(xié)同工作。因此，人們將透明質(zhì)酸與熒光/光聲造影劑結(jié)合制備納米材料，使其在細(xì)胞乃至活體的標(biāo)記性能和治療效果獲得了很大的改善。本文綜述了將兩類物質(zhì)結(jié)合制備納米材料的方法，著重闡述了納米材料的結(jié)構(gòu)與性能關(guān)系，為其未來設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了指導(dǎo)，最后對存在的主要問題以及未來的重要研究方向進(jìn)行了分析和展望。

　　關(guān)鍵詞透明質(zhì)酸;熒光成像;光聲成像;光熱治療;光動(dòng)力治療

　　1引言

　　對惡性腫瘤的早期診斷和有效治療是提高治愈率和存活率的一個(gè)重要手段[1-2]。作為用于惡性腫瘤臨床早期診斷和定位的非侵入式新興影像技術(shù)，熒光(FL)成像和光聲(PA)成像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用引起了人們的高度重視[3-7]。它們不需使用放射性物質(zhì)，具有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測、靈敏度高和費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)，而且有可能在成像的同時(shí)進(jìn)行治療。

　　其中，雙光子、近紅外(NIR)一區(qū)(750-1000nm)和NIR二區(qū)(1000-1700nm)熒光成像的激發(fā)波長在生物光學(xué)窗口范圍內(nèi)，與可見光區(qū)成像相比，生物組織對光的吸收和散射比較少，光致?lián)p傷小，自發(fā)熒光更弱，信噪比高，穿透能力更強(qiáng)，分辨率和靈敏度大幅度提高，近年來被廣泛應(yīng)用于各種疾病的實(shí)驗(yàn)研究，主要集中在腫瘤、炎癥和心血管疾病的早期診斷和治療效果的動(dòng)態(tài)監(jiān)測[8-13]。

　　光聲成像則結(jié)合了光學(xué)成像的高對比度、高分辨率和超聲成像的高穿透性優(yōu)勢，其原理是生物組織在脈沖近紅外激光照射下吸收光能將之轉(zhuǎn)為熱能，導(dǎo)致體積周期性膨脹，從而通過收集產(chǎn)生的超聲信號重構(gòu)生物組織影像，已經(jīng)在淋巴結(jié)、毛細(xì)血管、腦部腫瘤等的成像研究中取得了較好的結(jié)果[14-17]。而且，有的熒光造影劑被光激發(fā)后能同時(shí)產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化能力的活性氧(ROS)，可以作為光敏劑(PS)，有的光聲造影劑能把吸收的近紅外光能轉(zhuǎn)化為局部高熱，活性氧和局部高熱在病灶部位能夠有效殺傷疾病細(xì)胞。這兩種光療方法分別被稱為光動(dòng)力治療(PDT)和光熱治療(PTT)，不僅能進(jìn)行無創(chuàng)疾病治療，還可以通過對外加光源進(jìn)行控制，很好的區(qū)分病灶部位和正常組織，有效提高治療選擇性，減少副作用[17-21]。

　　目前，人們已研究開發(fā)出多種熒光/光聲造影劑，可分為無機(jī)材料(例如半導(dǎo)體納米晶、貴金屬Au和Ag納米粒子、上轉(zhuǎn)換納米粒子、碳基納米材料等)和有機(jī)材料(例如共軛材料、各種染料小分子等)。將這些造影劑直接進(jìn)行生物應(yīng)用時(shí)，其性能常存在如下共性問題：①水溶性較差，導(dǎo)致生物相容性低;②缺乏腫瘤靶向性和智能化響應(yīng)，信噪比較低，對正常組織的毒副作用較大，③功能比較單一，在多模態(tài)成像及多種治療方式相結(jié)合提高診療效果方面尚需進(jìn)一步探索。

　　為此，人們將熒光/光聲造影劑與透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid,HA)結(jié)合，使其性能獲得了很大的改善。HA是生物體內(nèi)的天然成分，由葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)的雙糖單位重復(fù)連接形成的鏈狀聚合物，分子中含有的大量羧基、羥基、酰胺基，使其在水溶液中可形成分子內(nèi)和分子間氫鍵，并產(chǎn)生多級結(jié)構(gòu)。

　　因此，HA具有優(yōu)異的水溶性和生物相容性，可實(shí)現(xiàn)多種超分子弱相互作用力(靜電作用、氫鍵作用、疏水作用和空間匹配等)協(xié)同工作，其分子中的四個(gè)部位——羥基、N-乙酰氨基、羧基以及還原末端，均可被化學(xué)修飾[9]。尤為重要的是，在多種腫瘤病變局部(如乳腺癌、肝癌、腦癌、胰腺癌和膀胱癌等)，若干HA特異性受體的表達(dá)會(huì)明顯升高(其中最重要是CD44受體)，因而HA衍生物具有主動(dòng)腫瘤靶向性，并且能被腫瘤細(xì)胞中高濃度的透明質(zhì)酸酶降解[27]。

　　因此，人們將HA和抗癌藥物結(jié)合起來，研究開發(fā)了大量的靶向給藥體系，很好的改善了藥物輸送和治療的效果[28]。近年來，人們又將熒光/光聲造影劑與HA的優(yōu)勢特性相結(jié)合，獲得了具有較好生物相容性和腫瘤靶向性的納米材料，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)熒光、光聲成像等多模態(tài)成像，以及光熱治療、光動(dòng)力治療或化療的協(xié)同治療功能。本文將主要就HA與熒光/光聲造影劑如何結(jié)合制備納米材料，及其在熒光、光聲成像和協(xié)同治療等方面的應(yīng)用做一簡要綜述。

　　2透明質(zhì)酸與熒光/光聲造影劑結(jié)合制備納米材料的方法

　　2.1化學(xué)修飾方法HA的化學(xué)修飾主要在以下三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行：

　　①GlcUA上的羧基，通常在水性條件下先用碳二亞胺和N-琥珀酰亞胺(NHS)或1-羥基苯并三唑(HOBt)使其活化得到活性酯，再與伯胺反應(yīng)成酰胺或與醇反應(yīng)成酯;②GlcNAc中C-6位上的羥基，用酸酐、酰氯或環(huán)氧化物等使其酯化或成醚;③二糖重復(fù)單元的還原端，可以對其進(jìn)行還原胺化來改性[29]。

　　目前，大部分熒光/光聲造影劑與HA的化學(xué)結(jié)合位點(diǎn)在羧基，但由于羧基在與HA受體的特異性相互作用中起重要作用，需要注意控制修飾的程度，研究表明對羧基的少量修飾(小于25%)不影響HA有效識(shí)別受體[30]。Luo等[31-32]在HA上通過酰胺鍵接枝氟化硼二吡咯甲川染料(BODIPY)，Shi等[33]合成了二碘苯乙烯基BODIPY(DBHA)，使其吸收和發(fā)射光譜紅移，并在HA上通過酯鍵進(jìn)行接枝。

　　3基于透明質(zhì)酸的納米材料應(yīng)用于熒光/光聲成像及光療

　　3.1HA與無機(jī)造影劑結(jié)合

　　無機(jī)熒光/光聲造影劑通常存在水溶性和生物相容性差的問題，無法直接用于生物體進(jìn)行成像或治療;或者粒徑過小，如果小于10nm，在體內(nèi)循環(huán)時(shí)容易被腎臟快速清除。

　　3.1.1半導(dǎo)體納米晶體量子點(diǎn)(QD)QD具有寬的激發(fā)光譜、窄的發(fā)射光譜、可精確調(diào)諧的發(fā)射波長以及良好的抗光漂白性能等優(yōu)越特性。Bhang等[34]將用靜電吸附法制備的HA-QD納米粒子對過量表達(dá)HA受體的HeLa(宮頸癌)細(xì)胞進(jìn)行熒光成像，證明其具有較好的靶向性和較小的細(xì)胞毒性。對裸鼠的耳朵皮下注射HA-QD進(jìn)行淋巴管系統(tǒng)成像，發(fā)現(xiàn)沿著血管內(nèi)壁具有明亮熒光的淋巴管清晰可見，證明其可與淋巴管內(nèi)皮受體1(LYVE-1)等作用進(jìn)入淋巴管內(nèi)細(xì)胞，具有數(shù)天的長時(shí)間成像能力，有希望用于實(shí)時(shí)顯示淋巴管生成，而未連接HA的QD成像結(jié)果則很模糊。

　　3.1.2Au、Ag納米粒子(NP)Au、AgNP具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，包括表面增強(qiáng)，距離/折射率依賴的光譜性質(zhì)和抗光漂白性能，在近紅外區(qū)域有強(qiáng)烈的吸收和有效的光熱轉(zhuǎn)換。Wu等[41]開發(fā)了一類具有核殼結(jié)構(gòu)的Ag-Au@PEG-HA雜化多功能納米凝膠。它以Ag-Au雙金屬NP為核，以熱響應(yīng)非線性PEG基凝膠為殼，能響應(yīng)溫度變化產(chǎn)生可逆膨脹和收縮，從而影響Ag-AuNP核的物理化學(xué)環(huán)境實(shí)現(xiàn)熒光傳感，同時(shí)控制抗癌藥物替莫唑胺的釋放;凝膠表面通過氫鍵再覆上HA，用于靶向小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞過量表達(dá)的CD44受體，提高成像效果。

　　這樣，Ag-Au@PEG-HA將環(huán)境響應(yīng)的熒光傳感、靶向癌細(xì)胞的熒光成像、光熱治療、可控藥物釋放等功能結(jié)合到一個(gè)體系中。Lee等設(shè)計(jì)了一系列納米Au與HA復(fù)合的熒光探針[42-44]。例如，將熒光素標(biāo)記的HA在還原末端修飾上多巴胺后，通過多巴胺與Au形成比Au-S鍵更加穩(wěn)定的Au-兒茶酚鍵，并且由于納米粒子HFAuNPs表面能量轉(zhuǎn)移使熒光素猝滅;而活性氧(ROS)，如超氧陰離子()和羥基自由基()，能降解HA，使熒光素的綠色熒光恢復(fù)，從而能實(shí)時(shí)定量檢測ROS。與常用市售2’,7’-二氯二氫熒光素(DCFH)等ROS探針相比，該探針監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)ROS的性能更優(yōu)異[42]，可以作為ROS的細(xì)胞成像探針。

　　3.2HA與有機(jī)造影劑結(jié)合

　　與無機(jī)材料相比，有機(jī)熒光/光聲造影劑易于通過結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)調(diào)控光譜范圍，進(jìn)行功能化修飾，生物毒性較低;但是水溶性仍需要改善，小分子在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短，易被化學(xué)分解。

　　3.2.1共軛材料

　　共軛材料包括共軛小分子和聚合物，具有摩爾吸收系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好和生物毒性較低的優(yōu)點(diǎn)[24,56]。人們將HA與共軛小分子[57-59]、共軛聚合物[39-40,60]等結(jié)合制備了一系列的納米材料。Huang等[40]在HA上共價(jià)連接阿霉素(DOX)，HA-DOX與陽離子型共軛聚合物PFEP通過靜電作用形成納米粒子，同時(shí)PFEP的熒光被DOX猝滅。當(dāng)納米粒子進(jìn)入HeLa細(xì)胞后，HA被透明質(zhì)酸酶(HAase)降解，因此PFEP熒光被激活，并由此實(shí)現(xiàn)對HAase的定量熒光檢測，以及靶向熒光成像和藥物控制釋放。

　　4總結(jié)與展望

　　HA具有優(yōu)異的水溶性、生物相容性，能與多種惡性腫瘤表達(dá)的受體特異性結(jié)合，可被透明質(zhì)酸酶降解，并且易于化學(xué)修飾，可實(shí)現(xiàn)多種超分子弱相互作用力協(xié)同工作。人們利用這些優(yōu)勢特性，能夠通過簡便的方法將HA與各種無機(jī)、有機(jī)熒光/光聲造影劑結(jié)合制備納米材料，提高造影劑的生物相容性，改善化學(xué)穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，延長在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間從而增強(qiáng)滲透與保留效應(yīng)，并能實(shí)現(xiàn)對乳腺癌、宮頸癌、肝癌、腦癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等腫瘤的主動(dòng)靶向。

　　另外，利用透明質(zhì)酸酶對HA的降解實(shí)現(xiàn)智能化可激發(fā)響應(yīng)，進(jìn)一步提高靈敏度和信噪比;而且，還易于同時(shí)負(fù)載其它類型造影劑或抗癌藥物制備復(fù)合納米材料，從而實(shí)現(xiàn)FL、PA、NMR、CT或PET成像等多模態(tài)靶向成像，以及光熱治療、光動(dòng)力治療或化療的協(xié)同治療功能，顯著提高了細(xì)胞乃至活體標(biāo)記效能和診療效率，減小治療的副作用。因此，該類納米材料具有很好的潛在臨床應(yīng)用前景。

　　迄今為止，該領(lǐng)域基本還處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，仍然存在很大研究空間。新型熒光/光聲造影劑的研究開發(fā)方興未艾，靈敏度、穿透性和安全性等性能更好的NIR-II熒光造影劑和光聲造影劑有待進(jìn)一步開發(fā);為了減少背景噪音、濃度干擾，準(zhǔn)確反映影像信號和疾病狀態(tài)的實(shí)時(shí)關(guān)系，將造影劑分子設(shè)計(jì)與HA結(jié)合，研制對腫瘤溫度、pH值、還原性物質(zhì)、活性氧、酶等產(chǎn)生多重可激發(fā)智能響應(yīng)的HA衍生物及其納米材料，將成為今后的重要發(fā)展方向。

　　納米材料論文：淺談醫(yī)學(xué)納米材料的應(yīng)用與發(fā)展

　　然而，該類納米材料要實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化，也面臨著很多亟待解決的問題和挑戰(zhàn)。體內(nèi)研究還處于起步階段，需要進(jìn)一步探索其與其它生物的系統(tǒng)相互作用，深入研究納米材料的結(jié)構(gòu)、形貌、尺寸等對細(xì)胞攝取、造影能力和治療效果的影響，提高體內(nèi)診療效率;對其在生物體內(nèi)的分布、生物毒性、體內(nèi)的降解及排除機(jī)理需要進(jìn)行更系統(tǒng)的評估，獲得長期生物安全、免疫反應(yīng)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)等更全面的體內(nèi)研究結(jié)果,為臨床實(shí)際應(yīng)用提供重要支撐。相信通過化學(xué)、材料、生物和醫(yī)學(xué)多學(xué)科領(lǐng)域科研工作者的合作和努力，這類材料可望在臨床診斷和疾病治療上產(chǎn)生重要的應(yīng)用價(jià)值。

　　作者：潘立祥黃艷琴*,盛況張瑞,c范曲立黃維