摘　要：在石油污染土壤兩端插入石墨電極，施加24 V直流電壓，使電極之間土壤電勢(shì)降達(dá)到1 V/cm。添加實(shí)驗(yàn)室篩選的高效石油降解菌，研究電動(dòng)-微生物聯(lián)合修復(fù)對(duì)石油污染土壤pH、土壤溫度、有機(jī)碳含量、有效氮、有效磷、有效鉀等指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，石油濃度為2%的模擬污染土壤經(jīng)過(guò)電動(dòng)微生物聯(lián)合技術(shù)處理后，最佳降解率達(dá)到67.5%。有效N、有效P、有效K分別平均提高為原來(lái)的1.5、1.4和1.2倍。外加電動(dòng)修復(fù)可以使土壤pH、溫度保持在一個(gè)相對(duì)恒定的變化范圍內(nèi)，為微生物的生命活動(dòng)提供了一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，提高石油降解率。

　　關(guān)鍵詞：電動(dòng)-微生物修復(fù);高效石油降解菌;石油

　　石油是石油污染場(chǎng)地土壤中的一種典型的持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，POPs)，含有難以生物降解的多環(huán)芳烴類(lèi)“三致”污染物。多環(huán)芳烴在降解時(shí)還產(chǎn)生大量有毒中間產(chǎn)物，污染土壤和地下水，最終進(jìn)入食物鏈[1-4]，可能導(dǎo)致生物突變。幾十年來(lái)，生物修復(fù)法被認(rèn)為是無(wú)害化、理想化的修復(fù)方法，它既不改變土壤的內(nèi)在性質(zhì)，也不會(huì)在修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生二次污染，還具有成本相對(duì)低廉、永久性消除污染物及公眾積極接受等優(yōu)點(diǎn)[5-7]，但其修復(fù)周期長(zhǎng)、效率低的缺點(diǎn)是限制其技術(shù)實(shí)際工程應(yīng)用的重要因素。

　　電動(dòng)力學(xué)修復(fù)是一種清理重金屬或有機(jī)污染土壤的創(chuàng)新技術(shù)，包括低功率直流電場(chǎng)對(duì)受污染土壤的控制應(yīng)用。該技術(shù)依賴(lài)于電遷移、電滲透和電泳3種過(guò)程，現(xiàn)已經(jīng)被用于去除土壤中的重金屬和有機(jī)污染物[3，8-9]。Hassan等[3]概述了重金屬、有機(jī)化合物和其他危險(xiǎn)品的電動(dòng)力學(xué)修復(fù)方法，但將其用于清除有機(jī)污染，如五戊烷、苯酚、五氯酚、木酚油、苯、甲苯和多環(huán)芳香芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)的石油污染土壤的研究并不多。

　　石油降解菌可以利用石油作為碳源來(lái)維持自身的生長(zhǎng)和代謝。有輔助電場(chǎng)時(shí)，可以提供持續(xù)的熱量，以增強(qiáng)高效石油降解細(xì)菌的作用。有機(jī)物和細(xì)菌在土壤中的緩慢運(yùn)動(dòng)傳統(tǒng)上是應(yīng)用電動(dòng)力學(xué)修復(fù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，利用電梯度驅(qū)動(dòng)土壤基質(zhì)石油、土壤的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)菌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并協(xié)同優(yōu)化這些因素提高了修復(fù)石油污染土壤的效率[10-12]。本研究通過(guò)建立一套電動(dòng)-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，提高石油污染土壤中有機(jī)污染物的降解效率，強(qiáng)化生物修復(fù)效果，實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)污染土壤的快速修復(fù)目標(biāo)。

　　1材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　1.1.1 污染物

　　以大慶油田南2區(qū)第1聯(lián)合站采集的石油作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，樣品的物理化學(xué)性質(zhì)。

　　1.1.2 土壤處理

　　原土樣來(lái)自沈陽(yáng)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站深度0～20 cm的頂土層。原有土壤的基本表征。為評(píng)價(jià)修復(fù)效果，采用人工配制的含油量均一的模擬含油土壤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將已經(jīng)處理的土壤與一定比例的石油均勻混合配制成含油量為2%的石油污染土壤。將石油污染土壤在土壤室內(nèi)自然風(fēng)干放置7 d，再取一定量于土壤室內(nèi)分別進(jìn)行不同處理。處理時(shí)間為100 d，每隔20 d采一次樣。采樣點(diǎn)距離陽(yáng)極分別為0、4、8、12、16、20、24 cm，采樣深度為10 cm。土壤含水率約為25%。

　　1.1.3 微生物和緩沖液的組成

　　將石油降解菌混合培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)用菌劑，在150 r/min、30℃的搖床培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在指數(shù)生長(zhǎng)期階段離心收獲培養(yǎng)菌劑，在去離子水中進(jìn)行重懸，得到1.2×1010CFU·mL–1的高濃度的菌懸液。將選定的優(yōu)勢(shì)菌種噴灑加入土壤中，含菌量為108CFU·mL–1，用量為0.01 mL·g–1土壤。加入一定量磷酸二氫鉀溶液、硝酸銨溶液為細(xì)菌復(fù)合物提供營(yíng)養(yǎng)，提高土壤的電導(dǎo)率并控制pH 6.5～7.0。在陰極儲(chǔ)層中使用磷酸二氫鉀(1 mol/L KH2PO4)溶液，在陽(yáng)極儲(chǔ)層中使用硝酸銨(1 mol/L NH4NO3)溶液。

　　1.2 儀器設(shè)備

　　本研究采用了2組電動(dòng)-微生物實(shí)驗(yàn)室裝置。第1組裝置用于優(yōu)化測(cè)試的極性反轉(zhuǎn)間隔，它由1個(gè)土壤電池、2個(gè)電極單元、1對(duì)由石墨制成的圓柱形電極、1個(gè)電極控制系統(tǒng)、1個(gè)電流和電壓實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)和1個(gè)電源組成。土壤單元由長(zhǎng)方形的有機(jī)玻璃制成，內(nèi)部尺寸長(zhǎng)26 cm，寬11 cm，高10 cm，使用2支長(zhǎng)10 cm，直徑0.5 cm的柱形石墨電極來(lái)產(chǎn)生1個(gè)不均勻的電場(chǎng)，該電極控制裝置能夠每24 h切換1次電場(chǎng)的極性。在土壤中插入電子溫度計(jì)，自動(dòng)記錄溫度并將數(shù)據(jù)傳輸?shù)诫娔X監(jiān)控系統(tǒng)。該監(jiān)控系統(tǒng)可在線監(jiān)測(cè)電流和電壓，并將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在電腦中供以便后續(xù)分析。電源采用恒定直流電，其源漏極電壓為1 V。裝置的電勢(shì)梯度為1 V/cm。第2組裝置除電極不轉(zhuǎn)換外與第1組裝置一致。

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 土壤pH分析方法土壤pH使用pH計(jì)(PHS-3C，上海儀電公司)測(cè)定。

　　1.3.2 土壤有效氮、有效磷、有效鉀和總有機(jī)碳的測(cè)定土壤的有效氮的測(cè)定方法是將土樣經(jīng)堿解后使用Multi N/C3000分析儀(Analytik Jena AG，Germany)測(cè)定;有效磷經(jīng)碳酸氫鈉提取后(Olsen法)采用鉬銻抗比色法測(cè)定;有效鉀經(jīng)醋酸銨提取后采用火焰分光光度法測(cè)定;總有機(jī)碳使用Multi N/C3000分析儀(Analytik Jena AG，Germany)測(cè)量。每個(gè)指標(biāo)均重復(fù)測(cè)試3次[13]。

　　1.3.3 土壤樣品中石油濃度的測(cè)定土壤中石油降解率采用紅外測(cè)油儀測(cè)定。每次準(zhǔn)確稱(chēng)取土樣10 g，置于50 mL的離心管中，加入30 mL三氯甲烷，加蓋，輕輕振搖1 min，放置過(guò)夜。次日，將離心管置于55℃水浴中熱浸1 h(開(kāi)始時(shí)注意打開(kāi)蓋放2次氣)，離心，取上清液置于燒杯中。此土樣繼續(xù)用上述步驟處理2次(僅將水浴加熱時(shí)間改為30 min)，每次取上清液繼續(xù)加入上述燒杯。然后把燒杯放在通風(fēng)櫥中，通風(fēng)濃縮至干，此即氯仿濃縮物[14]。最后把此濃縮物用四氯化碳定容，用紅外測(cè)油儀測(cè)其油含量。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1 土壤pH的變化

　　土壤酸堿度一般用pH表示，是影響土壤營(yíng)養(yǎng)元素相互轉(zhuǎn)化和有效性的重要因素。pH大小影響土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可利用程度和對(duì)污染物的降解效率[15]。土壤的起始pH為6.5。以實(shí)驗(yàn)2和實(shí)驗(yàn)6為例，實(shí)驗(yàn)24 h后的距離陽(yáng)極不同位置的土壤pH變化結(jié)果。實(shí)驗(yàn)2土壤pH變化范圍是3.5～12.7，pH變化幅度較大。外加電場(chǎng)在電極之間形成了一個(gè)電解池，土壤中的水分子在電場(chǎng)作用下發(fā)生了電解反應(yīng)，陽(yáng)極產(chǎn)生了大量的H+，使pH下降，陽(yáng)極周?chē)鷧^(qū)域呈現(xiàn)酸性;陰極產(chǎn)生大量的OH–，使pH升高，陰極周?chē)鷧^(qū)域呈現(xiàn)堿性[16]。在陽(yáng)極、陰極附近區(qū)域分別形成較強(qiáng)的酸性帶和堿性帶，極端的環(huán)境抑制了土壤微生物的生長(zhǎng)，不利于石油污染物的降解。

　　6號(hào)土壤陽(yáng)極和陰極附近區(qū)域土壤pH分別為5.5和7.3，其余位置的pH在6.2～6.4之間變化，整體要比土壤起始pH稍低，這可能是因?yàn)殡娊膺^(guò)程使得整體土壤的pH呈下降趨勢(shì)[17]。6號(hào)土壤pH接近中性，大部分變化范圍在微生物適生變化范圍之內(nèi)(微生物適生pH范圍為6.0～7.5)[8]。從結(jié)果可以看出，通過(guò)電極切換，有效地避免了在某一端電極周?chē)�形成的�?qiáng)酸性區(qū)域或強(qiáng)堿性區(qū)域，將土壤pH控制在適于微生物生長(zhǎng)的范圍內(nèi)，相對(duì)于電極不切換的土壤環(huán)境，電極切換給微生物提供了一個(gè)良好的、穩(wěn)定的生存環(huán)境，可以有效提高微生物對(duì)石油的利用效率。

　　2.2 土壤溫度的變化

　　土壤維持一個(gè)恒定、適宜的溫度，對(duì)微生物的生命活動(dòng)有著重要的意義。在20～45℃條件下，微生物的生長(zhǎng)速度較快，生命活動(dòng)旺盛[18]，微生物的活性增強(qiáng)有利于去除土壤中存在的石油等有害物質(zhì)[19]。對(duì)實(shí)驗(yàn)3、實(shí)驗(yàn)4和實(shí)驗(yàn)7的溫度變化進(jìn)行24 h監(jiān)測(cè)，每4 h記錄一次 。

　　溫度變化范圍為12.4～23.2℃，最大溫差達(dá)到10.8℃。實(shí)驗(yàn)4和實(shí)驗(yàn)7土壤溫度變化范圍不大，實(shí)驗(yàn)4土壤最高溫度30.3℃出現(xiàn)在16 h時(shí)，最低溫度29.4℃出現(xiàn)在4 h時(shí)，24 h內(nèi)溫差為0.9℃。實(shí)驗(yàn)7土壤的最高溫度31.2℃出現(xiàn)在12 h時(shí)，最低溫度出現(xiàn)在4 h時(shí)，24 h內(nèi)的溫差為1.8℃。實(shí)驗(yàn)3 在24 h內(nèi)溫度變化顯著，溫差超過(guò)10℃，土壤環(huán)境變化相對(duì)較大。

　　實(shí)驗(yàn)4溫差較小，平均溫度為29.9℃，比實(shí)驗(yàn)3的平均溫度高12.3℃，受外界溫度影響小，溫度波動(dòng)變化在1℃以?xún)?nèi)，土壤環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，為土壤中的微生物提供了一個(gè)良好的生存環(huán)境。實(shí)驗(yàn)7在12 h出現(xiàn)一次溫度升高，在圖3中可以看到1個(gè)較小的溫度的波動(dòng)峰。這可能是由于12 h時(shí)進(jìn)行電極切換，持續(xù)的單向電流突然改變方向，土壤中的各種帶電顆粒表面電荷轉(zhuǎn)變方向，釋放能量，增加了土壤溫度。總體來(lái)看，微生物處于20～45℃之間，且波動(dòng)范圍較小的溫度環(huán)境更適宜微生物生存，由此也會(huì)提供更好的降解能效。

　　實(shí)驗(yàn)4和實(shí)驗(yàn)7的平均溫度均是實(shí)驗(yàn)3平均溫度的1.7倍以上，其原因可能是由于外加電場(chǎng)的一部分電能轉(zhuǎn)化為熱能釋放到土壤當(dāng)中，持續(xù)的電流維持著土壤溫度。土壤的pH也與溫度有關(guān)，恒定的溫度有利于土壤的pH的穩(wěn)定。這些條件都為微生物降解土壤中的石油提供了一個(gè)適宜的環(huán)境，加大了降解效率。實(shí)驗(yàn)4和實(shí)驗(yàn)7的降解率高于實(shí)驗(yàn)3的，也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

　　2.3 土壤有機(jī)碳含量的變化

　　石油等大分子的碳?xì)浠�合物�?jīng)過(guò)高效石油降解菌的作用，能夠被分解成小分子碳?xì)浠�合物等�?jiǎn)單的有機(jī)物[20-21]。這些有機(jī)物對(duì)石油等疏水有機(jī)污染物在環(huán)境中的的分配、遷移和生物有效性均起到控制作用。同時(shí)土壤溶液中存在的土壤有機(jī)化合物可以影響石油等多環(huán)芳烴在土壤表面的吸附。

　　這一現(xiàn)象應(yīng)該歸因于在電場(chǎng)作用下推動(dòng)帶有負(fù)電的微生物向電勢(shì)高的區(qū)域遷移，在陽(yáng)極附近聚集了大量的微生物;同時(shí)外加電場(chǎng)在陽(yáng)極處發(fā)生強(qiáng)烈的氧化還原反應(yīng)，刺激微生物加速新陳代謝，加大碳源的消耗。有機(jī)碳在土壤中多以膠體形式存在，帶有大量的負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下，通過(guò)電泳的移動(dòng)方式向陽(yáng)極遷移。這也為陽(yáng)極區(qū)域的微生物提供了碳源。同時(shí)在遷移過(guò)程中有機(jī)碳吸附大量的水分和陽(yáng)離子，其吸水率比黏粒要大幾倍甚至幾十倍，它能降低黏性土壤的黏性，同時(shí)改變土壤孔隙狀況和水、氣比例，有利于土壤中微生物的呼吸和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在土壤中的傳遞。

　　同一位點(diǎn)修復(fù)過(guò)程中有機(jī)碳消耗速率也不同。最初20天的有機(jī)碳平均消耗為總量的6.2%，隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)消耗速率逐漸降低，60天后有機(jī)碳平均消耗降低到僅為總量的1.6%。實(shí)驗(yàn)7各位點(diǎn)的有機(jī)碳含量表現(xiàn)為兩極少，中間多。切換電極使得電極兩端輪流處于陽(yáng)極狀態(tài)，陽(yáng)極附近氧化還原反應(yīng)較強(qiáng)，電子交換頻率較快，刺激微生物的生命活性增強(qiáng)，新陳代謝加速，消耗有機(jī)碳的速度較快，能夠加速高效降解菌對(duì)石油的降解。20 d內(nèi)消耗有機(jī)碳最多達(dá)到總量的9.3%，平均消耗有機(jī)碳相當(dāng)于總量的7.2%。隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，有機(jī)碳的消耗速度，呈先快后慢，修復(fù)60 d后，有機(jī)碳的消耗速度降低。在今后的實(shí)驗(yàn)中，可以考慮添加一些外來(lái)營(yíng)養(yǎng)物作為碳源。

　　3結(jié)　語(yǔ)

　　電動(dòng)-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)有很好的石油污染土壤修復(fù)效果。每24 h切換一次電極，有效地中和了陽(yáng)極和陰極產(chǎn)生的H+和OH–，為高效降解菌提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生存環(huán)境，提高了石油的降解率。定期切換電極使土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)非定向遷移，分散到土壤的各個(gè)部分，能夠最大程度為較多微生物提供營(yíng)養(yǎng)源，延長(zhǎng)其生命周期，加速其繁殖速度，有利于提高石油降解率。外加電場(chǎng)一定程度上提高了土壤有效N、P、K的含量，為微生物提供了生存必需的營(yíng)養(yǎng)元素，促進(jìn)了微生物的修復(fù)效果。在電動(dòng)-微生物耦合修復(fù)技術(shù)基礎(chǔ)上添加微生物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高了微生物活性，同時(shí)也強(qiáng)化了電動(dòng)修復(fù)的效果。最佳石油降解率達(dá)到67.5%。

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　　作者：李婷婷， 吳　迪， 辛　亮， 王恩彪， 趙紫鈺， 彭　湃