摘要為了評價草莓葉水提物(SLWE)延緩皮膚衰老功效，對SLWE成分、抗氧化活性、抑制非酶糖基化(NEG)能力進行了測定;探討了SLWE對人包皮成纖維細胞(HFF-1)細胞活率、HFF-1中透明質酸(HA)、人Ⅰ型膠原蛋白(COLⅠ)、羥脯氨酸(HYP)、基質金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)含量的影響。在中波紫外線(UVB)致HFF-1損傷模型基礎上，考察了SLWE對保護組活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、MMP-1和超氧化物歧化酶(SOD)的影響，探討SLWE對UVB致HFF-1損傷保護機制。結果表明，SLWE富含VC、槲皮素、綠原酸、沒食子酸及兒茶素類物質，其中，槲皮素含量12.86mg/L，表兒茶素含量10.13mg/L。SLWE自由基清除能力良好，清除不同自由基能力依次為O2-•>DPPH>ABTS>亞鐵離子螯合>•OH;體積分數為1%的SLWE水溶液對NEG的抑制率為87.17%;體積分數大于3%的SLWE水溶液可提高HFF-1中HA、COLI和HYP含量(P<0.05)，體積分數為6%的SLWE水溶液可降低MMP-1含量(P<0.01)，表明SLWE具有提升皮膚含水量，增加膠原含量，抑制膠原降解，實現延緩衰老的功效;SLWE可有效降低因UVB刺激而產生的ROS，體積分數6%的SLWE水溶液可顯著降MDA，抑制MMP-1表達，提高SOD活力，說明SLWE有助于緩解氧化應激造成的細胞損傷。

　　關鍵詞草莓葉水提物;UVB;人包皮成纖維細胞;損傷保護;延緩衰老;醫藥與日化原料

　　成纖維細胞分泌的膠原纖維、彈性纖維及基質成分，對維持皮膚正常生理狀態具有重要意義。皮膚經紫外線長期或大量照射后，會引發光損傷[1]，UVB刺激皮膚產生過多活性氧(ROS)，激活細胞氧化應激反應，脂質、蛋白質氧化、線粒體及DNA受損、細胞膜通透性改變，成纖維細胞周期停滯和凋亡，進而引起皮膚細胞外基質中的膠原蛋白、彈性蛋白及透明質酸降解，造成組織損傷，加速皮膚老化[1-2]。

　　目前，針對草莓的精深加工主要集中在草莓果實，而草莓葉作為草莓生產過程的副產品，大多采用填埋、焚燒等處理方式，存在環境污染等問題。針對不同葉齡的草莓葉制作的草莓葉保健茶研究發現，其含有大量VC、鞣花酸、可溶性糖、原花青素、槲皮素、兒茶素、游離氨基酸等，尤其是VC，其含量可高達每百克葉片160~170mg[3-4]，具有良好的抗氧化活性及延緩衰老功效。但目前針對草莓葉提取物相關功效評價的研究較少，作用機制不明確。本研究制備了草莓葉水提物(SLWE)，并對其進行成分測定、抗氧化及延緩衰老功效評價，同時探討SLWE對UVB致成纖維細胞損傷保護機制，為其在延緩皮膚衰老方面的應用提供依據，推動草莓副產品價值的深入挖掘和應用。

　　1實驗部分

　　1.1材料、試劑與儀器

　　草莓(Fragaria×ananassa)葉片，北京欣寶萊科技有限公司提供。甲醇、乙腈、乙酸、pH2.5磷酸水溶液(色譜級)，鹽酸氨基胍、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖、甲醇、醋酸鈉、無水三氯化鐵(FeCl3)、七水合硫酸亞鐵(FeSO4•7H2O)(以上均為AR)，美國Sigma-Aldrich公司;DMEM高糖培養基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，美國Hyclone公司;青鏈霉素混合液(100×)、胰酶-EDTA、小牛血清(FBS)(以上均為AR)，美國ThermoFisher公司;CellCountingKit(CCK-8)試劑盒、活性氧(ROS)試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)、透明質酸(HA)試劑盒，碧云天生物技術公司;丙二醛(MDA)檢測試劑盒、羥脯氨酸(HYP)試劑盒，南京建成生物研究所;人I型膠原(COLI)酶聯免疫檢測試劑盒、人基質金屬蛋白酶1(MMP-1)試劑盒、人基質金屬蛋白酶9(MMP-9)試劑盒，武漢華美生物有限公司;人包皮成纖維細胞(HFF-1)，中國科學院干細胞庫;去離子水，自制。

　　Agilent1220InfinityII液相色譜系統，AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱(250mm×4.6mm×5µm)，AgilentZORBAXSB-Aq柱(250mm×4.6mm×5µm)，安捷倫科技(中國)有限公司;InfiniteM200PRO酶標儀，瑞士Tecan公司;IX73研究級熒光倒置顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司;LGJ-18真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司;EB-160C/FC手持式紫外燈，美國Spectroline公司。

　　1.2SLWE制備將新鮮草莓葉置于真空冷凍干燥機中，在真空度100Pa，功率1400W，-60℃條件下，干燥24h，冰上磨粉，過100目篩，得到草莓葉凍干粉。按料液比1:20(g:mL)加入草莓葉凍干粉和去離子水，在常溫(20℃)，60Hz條件下超聲輔助浸提0.5h后，于8000r/min離心10min，離心處理2次，取黃綠色上清液，即為SLWE，用孔徑為0.22μm微孔濾膜過濾除菌，備用。

　　1.3SLWE成分測定利用高效液相色譜儀對SLWE成分進行測定，主要依據國標或衛生標準中的方法。以VC為例，其測試原理為：以VC標準品和去離子水制備不同質量濃度的VC標準工作液，再對測試樣以色譜峰的保留時間定性，通過外標法對其進行定量。按照GB5009.86—2016《食品安全國家標準食品中抗壞血酸的測定》第一法測定VC含量;按照《保健食品檢驗與評價技術規范(2003年版)》保健食品功效成分及衛生指標檢驗規范第二部分(十六)測定槲皮素含量;按照GB/T22250—2008《保健食品中綠原酸的測定》測定綠原酸含量;按照GB/T8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》測定沒食子酸和兒茶素類含量。

　　1.4SLWE抗氧化活性測定

　　1.4.1還原力測定

　　采用鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)法[5]，以0.1mmol/LTrolox為陽性對照，以自制去離子水稀釋，測定SLWE(體積分數分別為0.01%、0.1%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%)水溶液的FRAP值。

　　1.4.2自由基清除能力測定

　　以自制去離子水稀釋，以VC(質量分數0.1%)水溶液為陽性對照，參照XIE等[6]方法測定SLWE(體積分數分別為0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.0%、100.00%)水溶液的DPPH•清除能力;參照RE等[7]方法測定SLWE(體積分數分別為0.10%、0.25%、1.00%、10.00%、100.00%)水溶液的ABTS•清除能力;采用鄰苯三酚自氧化法[5]，測定SLWE(體積分數分別為0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的O2-•清除能力。采用YOU等[8]方法測定SLWE(體積分數分別為0.10%、1.00%、2.50%、10.00%、100.00%)水溶液的•OH清除能力;以EDTA-2Na(質量分數0.01%)水溶液為陽性對照，參考GÜLÇIN[9]方法測定SLWE(體積分數分別為0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的金屬離子螯合能力。

　　1.5SLWE抑制非酶糖基化(NEG)能力

　　參考莊秀園[10]的方法，以質量分數為0.1g/L的鹽酸氨基胍水溶液為陽性對照，pH7.4PBS為空白對照，樣品自身熒光強度為樣品本底對照，以激發波長370nm和發射波長440nm檢測熒光強度，測定SLWE(體積分數分別為0.1%、0.2%、1.0%、10.0%、100.0%)對NEG的抑制率，按式(1)計算。NEG抑制率/%=[1-(A樣品-A樣品本底)/A空白]×100(1)1.6SLWE對正常生長HFF-1的影響1.6.1HFF-1細胞培養選擇生長狀態良好、對數生長期的HFF-1置于DMEM高糖培養基[含10%胎牛血清(體積分數)、100U/mL青霉素鈉、100mg/L鏈霉素]，于37℃、5%CO2(體積分數)、飽和濕度進行培養，每3d更換1次培養基。生長約80%融合時，V〔0.25%(質量分數)胰酶〕:V(EDTA)=1:2培養基，進行HFF-1傳代。

　　2結果與討論

　　2.1SLWE成分測定

　　采用高效液相色譜法對SLWE中的VC、槲皮素、綠原酸、沒食子酸及兒茶素類進行鑒定，SLWE富含VC、槲皮素、綠原酸、沒食子酸及兒茶素類，槲皮素含量最高，達12.86mg/L，表兒茶素10.13mg/L。研究發現，兒茶素類是草莓葉中的主要抗氧化劑之一[12]，同時草莓葉富含VC[13]、槲皮素[14-15]、沒食子酸[16-17]、綠原酸[18]等，均為已知抗氧化劑，說明SLWE具有作為抗氧化劑的可能。

　　2.2SLWE抗氧化活性測定

　　2.2.1還原力測定

　　依據SLWE對Fe3+的還原力評價其抗氧化能力，擬合得到的FeSO4•7H2O回歸方程為y=0.3405x+0.0017(R2=0.998)。UVB損傷組HFF-1中MDA和MMP-1含量顯著提高，SOD酶活力顯著降低，說明UVB對HFF-1有明顯損傷作用，同時影響HFF-1清除ROS。與UVB損傷組相比，體積分數為6%的SLWE水溶液可顯著降低MDA含量，抑制MMP-1表達，提升SOD活力，并且呈現一定的劑量依賴性，說明SLWE對UVB致HFF-1損傷具有保護作用，同時可顯著提高細胞抗氧化能力，緩解氧化應激造成的細胞損傷。

　　醫學論文投稿刊物：《環境與職業醫學》(月刊)創刊于1984年，創辦近20年來，一直被中國職業醫學界列為最重要學術期刊之一。2001年由李改為雙月刊，2002年正式更名為《環境與職業醫學》。該刊載文量約40萬以上。省部級以上(包括國際性科研基金項目資助，已先后獲獎。

　　3結論

　　SLWE富含槲皮素、表兒茶素、VC等多種具有顯著抗氧化性成分，且具有良好的自由基清除能力。體積分數大于0.3%的SLWE水溶液可有效去除細胞中的ROS，同時緩解由外源條件，如光照(UVB)等造成的細胞損傷，提高HA含量，提升皮膚含水量，為皮膚提供有利的組織環境;此外，SLWE具有促進HYP和COLI表達，增加膠原含量，抑制MMP-1表達，減少膠原分解的功效，同時阻止膠原發生糖化反應交聯變黃。因此，SLWE具有多角度全方位維持皮膚彈性、結構和含水量，減少皮膚暗淡、松弛和皺紋。SLWE可作為一種良好的抗氧化和延緩衰老功效原料，可應用于食品、保健品、化妝品等相關領域，促進草莓葉“廢物利用”，挖掘草莓經濟效益。

　　參考文獻：

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　　[4]WANGLN(王麗娜)，CHANGLL(常琳琳)，WANGGX(王桂霞)，etal.AnalysisofnutrientcompoundsinStrawberryleavesbeforeandaftertheprocessing.AdvancesinstrawberryresearchIV[M]..Beijing：ChinaAgricuturePress(中國農業出版社)，2015：151-155.

　　作者：董坤1，翟文麗1，王蘭青2，何聰芬