摘要植物病毒粒子作為納米級顆粒，具有在植物細胞內積累水平高、再生成本低、純化工藝簡單及對人體安全等優點，是一種理想的天然納米材料。隨著生物納米技術的發展，植物病毒納米顆粒在醫學領域展現出越來越大的應用潛力，本文圍繞靶向傳遞藥物、分子成像和疫苗制備綜述了植物病毒納米顆粒在醫學領域的研究進展和應用。

　　關鍵詞植物病毒;納米顆粒;成像;疫苗;藥物傳遞

　　0引言

　　近年來，可用于癌癥治療的各種能夠輸送藥物的納米載體在醫學中應用備受關注，相較于傳統的藥物遞送平臺，納米載體具有較大比表面積而容納更多藥物或標記物，并可通過修飾連接特殊配體來增強其靶向性。目前有多種人工合成納米載體，如，合成聚合物、脂類、碳納米管等[1-2]在載藥量、靶向傳遞能力、穩定性等方面各有優缺點，考慮到毒性和對環境的影響，目前研究者們更多地集中在一些天然的納米載體材料上，如，噬菌體MS2、小型熱休克蛋白、鐵蛋白、病毒納米顆粒(Viralnanoparticles,VNPs)等[3-5]。

　　醫學論文范例：臨床醫學檢驗重要環節的質量控制研究

　　自然界中病毒，具有納米級大小、高度對稱三維蛋白結構、良好生物相容性和水溶性、可進行各種遺傳/化學修飾等優點，在醫學領域有著巨大應用潛力。來源于植物的病毒不會感染人畜，相比較于動物病毒更加安全[6]。本文將主要從靶向傳遞藥物、分子成像和疫苗制備三個方面，綜述植物病毒納米顆粒在醫學領域的研究進展。

　　1在靶向傳遞藥物方面的應用

　　相比較于口服，利用納米載體輸送藥物能提高藥物分子的局部濃度，減少藥物吸收時的損失[6]。植物病毒粒子作為納米材料，可以連接或包埋藥物，用于疾病的治療。Shriver等[12]以豇豆花葉病毒(Cowpeamosaicvirus,CPMV)為載體，成功向受損中樞神經系統遞送治療藥物。遞送藥物時，載體在體內循環時間越長，藥物在靶向組織中積累量越高[13]，而載體在體內滯留時間與載體表面所帶電荷以及表面是否修飾有關[14]。

　　運輸藥物的載體多為小分子納米材料，但帶有負電荷的納米載體在體內半衰期短[3,15]。聚乙二醇修飾，不僅能夠增加納米載體的穩定性和溶解度，還能減少納米載體與體內蛋白或細胞相互作用，使得其在生物體內的半衰期提高、穩定性增加和免疫原性降低[16]。基于馬鈴薯X病毒(otatovirusX,PVX)和CPMV制備的病毒樣粒子經聚乙二醇修飾后降低免疫原性;經動物實驗證實，修飾后病毒粒子在小鼠的腫瘤部位滲透更強、積累更多，更有利于抗癌藥物的遞送和成像[17]。

　　腫瘤細胞表面蛋白可作為標記物，用于區分腫瘤與正常組織[8-10]。植物VNPs連接上腫瘤標記物后在運輸藥物可直接靶向腫瘤而不影響其它正常組織，如F56肽能與血管表皮生長因子受體1(Vascularepithelialgrowthfactorreceptor,VEGFR-1)特異性結合，在移植有人類結腸癌細胞的小鼠模型中，表達F56肽的CPMV納米顆粒能夠靶向于高表達VEGFR-1的腫瘤細胞[11]，在一定程度上減少了藥物的副作用。植物病毒納米顆粒外殼蛋白(Coatprotein,CP)中有許多裸露氨基酸殘基，如，賴氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等，可通過化學修飾方法與抗體、寡核苷酸、藥物或其它小分子連接起來[18-19]，從而使病毒粒子功能化。

　　Wang等[20]通過N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-hydroxysuccinimideester)將熒光素或生物素結合在CPMV表面，使得CPMV能用于成像或定位。在各種形態的植物病毒中，二十面體的植物病毒粒子具有較大的內部空間，是目前研究最多的用于裝載小分子物質的載體[21]。通過改變溶液的金屬離子濃度和pH值，二十面體植物病毒CP的間隙逐漸增大[22]，藥物通過孔隙擴散到病毒內部，逆轉條件，CP的間隙重新縮小，最終將藥物封裝在內。

　　Ren等[21]以二十面體木槿褪綠斑駁病毒(Hibiscuschloroticringspotvirus,HCRSV)為載體封裝抗癌藥物阿齊霉素，制備成直徑約30nm的蛋白籠，并在病毒粒子的表面連接上葉酸，賦予其靶向腫瘤的能力，改造后的HCRSV能將更多的藥物輸送到腫瘤部位，增強疾病治療效果。黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)[23]、CPMV[24]、紅三葉壞死花葉病毒(Redclovernecroticmosaicvirus,RCNMV)[25]等也被證實能夠隨著pH值變化而改變病毒粒子構象，從而將相關藥物封裝于內部。除了通過改變pH值改變植物VNPs構象外，一些藥物還可以與植物VNPsCP內表面的帶電荷氨基酸殘基，或腔內帶負電荷的核酸，通過靜電相互作用被包封在植物VNPs的內腔[7,26]。

　　病毒CP中部分帶電荷氨基酸殘基對核酸有較強親和性，能夠穩定包裹遺傳物質，具有傳遞基因藥物的潛力[27]。豇豆褪綠斑駁病毒(Cowpeachloroticmottlevirus,CCMV)已被證實可高效地自發封裝許多長單鏈RNA，并將其在相應位置釋放[28]。Azizgolshani等[28]研究發現，CCMV的CP與異源RNA體外自組裝而成的雜合病毒顆粒，能夠在哺乳動物細胞的胞質中釋放異源RNA。植物VNPs的CP作為堅固的外部支架，能夠保護其封裝的基因藥物不受核酸酶降解的影響，且具有進一步功能化和細胞靶向的可能，為相關疾病的基因治療提供了可行的方案。

　　2在成像方面的應用

　　修飾方法的多樣性和精確裝配的優勢使得植物病毒納米顆粒能夠用于制備成像探針。目前，植物病毒納米顆粒已被用于光學成像、磁共振成像(Magneticresonanceimaging,MRI)和正電子發射斷層掃描[29]。在成像過程中，清除攜帶成像試劑的載體滯留組織所引起的毒性至關重要，與一些需要數月才能清除的合成納米材料(碳納米管、金顆粒和二氧化硅)相比，植物病毒納米顆粒易從體內清除，且半衰期短，大大降低了納米載體滯留對機體產生的毒性[13]。

　　熒光成像是目前腫瘤評估的重要方式，熒光劑可以通過生物偶聯、基因工程和自組裝等方式整合到植物病毒CP上[29]。在使用流式細胞術研究細胞特異性顆粒攝取、通過共聚焦顯微鏡觀察顆粒定位以及通過體內成像確定生物分布的過程中，熒光展現出至關重要的作用[30]。CPMV連接熒光分子Oregongreen-488制備而成的病毒熒光探針可用于檢測CPMV在活體小鼠體內的循環路徑，口服數天后，可在小鼠體內的腎、肺、胃、空腸、回腸和大腦等組織檢測到CPMV，且從小鼠組織中回收的病毒納米顆粒結構并未受到破壞[31]。

　　在煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)納米顆粒CP的內表面連接近紅外熒光染料和鏑(Dy3+)，外表面連接天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸，制備的納米顆粒具有良好生物相容性和較低細胞毒性，在體內和體外都能夠靶向前列腺癌細胞PC-3[32]，為植物病毒用于癌細胞的檢測提供了可行性。活體血管成像是一種強大的工具，可用于無創檢測和可視化疾病。常用的成像試劑載體有納米球[33]、氧化鐵顆粒[34]和脂質體[35]等，但存在穩定性、毒性或生物利用度等缺陷，且分辨率和穿透深度還有待提升。植物VNPs表面有多個化學試劑反應位點，且具有良好的生物相容性和惰性，使得植物VNPs成為一種優良的熒光染料多價展示平臺。植物VNPs能與血管內皮細胞表面的蛋白相互作用[7,36]，可用于標記血管，進而用于生物體內部組織的成像。

　　高密度偶聯熒光染料的CPMV可以在雞胚和活鼠中顯示血管系統和血流，深度可達500μm，持續時間長達72h，分辨率優于類似大小的熒光納米球[31]，熒光標記CPMV還能可視化人纖維肉瘤導致的腫瘤血管[31]。植物VNPs直徑大多在5~100nm之間，具有較大的比表面積，能夠承載數以百計的釓離子，剛性分子結構和較大的扭轉系數使得植物VNPs能夠提供很高的弛豫度，因此，植物VNPs表面經釓離子修飾后，可用于制備MRI造影劑[37-38]。

　　3在疫苗制備方面的應用

　　3.1腫瘤疫苗

　　腫瘤疫苗是指通過表達特異性的、有免疫原性的腫瘤抗原，在細胞因子、趨化因子等佐劑的輔助下，激活或加強患者自身的免疫系統，進而殺傷、清除腫瘤細胞;與化療相比，腫瘤疫苗具有副作用小、避免耐藥性和誘導長期免疫等優點，是近年的研究熱點之一[37]。

　　2010年4月，美國食品藥品監督管理局(Foodanddrugadministration,FDA)批準Provenge/sipuleucel-T用于治療晚期前列腺癌，Provenge/sipuleucel-T是世界上第一個依靠自體主動免疫的治療性癌癥疫苗，為其它同類產品的研發鋪平了道路[38]。

　　3.1.1多肽疫苗

　　在過去的二十年中，植物VNPs作為外源多肽和蛋白表達載體的研究正逐漸興起。植物VNPs，尤其是來自CPMV或TMV的納米顆粒有望成為多肽疫苗研發的平臺[39-40]。多個抗原分子有序排列可有效調控免疫細胞的活性，進而誘導機體產生特異性免疫反應，無包膜植物VNPs的CP亞單位在三維空間上排列規則而有序，能夠在納米尺度上精確的展示和排列功能性結構單元，使植物VNPs成為抗原和/或半抗原的理想表達載體[40-41]。

　　植物VNPs可通過化學交聯劑與多肽或完整的蛋白質抗原相連接，交聯劑與植物VNPs表面的反應性基團特異性結合，從而將連接的抗原展示在病毒顆粒表面[41]，該方法對抗原表位的大小沒有限制，且可進行多價展示，將多種不同的抗原表位同時暴露在一個病毒顆粒的表面[42]。目前已有多種螺旋狀的植物病毒通過化學連接的方式在表面展示外源多肽，如Shukla等[43]將來源于人表皮生長因子受體2(Humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER2)胞外結構域的P4肽與PVX連接，制備成HER2疫苗，該疫苗免疫小鼠后能檢測到HER2特異性抗體，克服機體對HER2的免疫耐受，有望應用于乳腺癌的預防和治療。

　　4總結

　　植物病毒作為一種天然的納米材料，可以靶向傳遞藥物，易生物降解，對人體安全，便于修飾和改造，在醫學領域有著巨大的應用潛力。植物病毒在植物細胞內高水平積累，再生成本低，純化工藝簡單，對于發展中國家而言，是生產安全廉價疫苗的良好選擇[56]。植物病毒具有穿透實體腫瘤的能力，在應用于腫瘤治療的各種納米載體中有著巨大的優勢。藥物可以修飾在植物病毒的表面或包封于內腔，靶向疾病部位后能夠提高藥物的局部濃度，達到增強療效和延長半衰期的效果。植物病毒還能通過基因修飾或化學連接的方式在CP上展示腫瘤抗原，通過修飾加上配體，則能制備成靶向性更強的腫瘤疫苗，更好地激發機體抗腫瘤免疫。

　　多種植物VNPs和缺乏遺傳物質的病毒樣顆粒已被證實能在多種腫瘤模型下誘發強大的局部免疫，不同形態的植物VNPs會引發不同類型的免疫反應，因此，深入研究不同植物VNPs激活免疫的分子機制，明確其作用途徑和靶點，挑選出最有效的植物病毒種類，使得該技術從實驗室研究到臨床應用轉化成為可能。此外，植物病毒還能連接熒光物質，用于制備成像試劑。綜上所述，植物VNPs有著諸多優勢，在醫學領域有著廣泛的應用前景，目前，植物VNPs在藥物靶向治療和分子成像領域已有較多研究，但在疫苗領域還處于早期探索階段，需要進一步研究來推動納米疫苗的制備。

　　參考文獻：

　　[1]AfroozH,AhmadiF,FallahzadehF,etal.Designandcharacterizationofpaclitaxel-verapamilco-encapsulatedPLGAnanoparticles:potentialsystemforovercomingP-glycoproteinmediatedMDR[J].JournalofDrugDeliveryScienceandTechnology,2017,41:174-181.

　　[2]ChoKJ,WangX,NieSM,etal.Therapeuticnanoparticlesfordrugdeliveryincancer[J].ClinicalCancerResearch,2008,14(5):1310-1316.

　　[3]KaiserCR,FlennikenML,GillitzerE,etal.Biodistributionstudiesofproteincagenanoparticlesdemonstratebroadtissuedistributionandrapidclearanceinvivo[J].InternationalJournalofNanomedicine,2007,2(4):715-733.

　　[4]LeDHT,LeeKL,ShuklaS,etal.PotatovirusX,afilamentousplantviralnanoparticlefordoxorubicindeliveryincancertherapy[J].Nanoscale,2017,9(6):2348-2357.

　　[5]CzaparAE,ZhengYR,RiddellIA,etal.Tobaccomosaicvirusdeliveryofphenanthriplatinforcancertherapy[J].AcsNano,2016,10(4):4119-4126.

　　作者：杜志游，周昀茜，董溫昕