《水解貝殼硬蛋白美白功效的初步研究》論文發(fā)表期刊：《藥物生物技術(shù)》；發(fā)表周期：2021年03期

《水解貝殼硬蛋白美白功效的初步研究》論文作者信息：陸垚嘉，女，浙江湖州人，大學(xué)本科，浙江歐詩(shī)漫生物股份有限公司技術(shù)研發(fā)部技術(shù)員，主要方向: 珍珠應(yīng)用基礎(chǔ)研究。王菁，女，浙江蘭溪人，碩士研究生，浙江歐詩(shī)漫生物股份有限公司技術(shù)研發(fā)部副部長(zhǎng)，主要方向: 珍珠應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

　　摘 要 研究水解貝殼硬蛋白( Shell protein extract，SPE) 對(duì) B16 細(xì)胞內(nèi)黑色素含量及酪氨酸酶活性的影響。培養(yǎng) B16 細(xì)胞，構(gòu)建 α-黑素細(xì)胞刺激素( α-MSH) 誘導(dǎo)細(xì)胞的黑色素高表達(dá)量細(xì)胞模型。SPE 作用 B16 細(xì)胞， CCK8 法測(cè)定細(xì)胞活力; NaOH 裂解法和 L-DOPA 氧化法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)黑色素含量和酪氨酸酶活性的變化。結(jié)果顯示，SPE 在 1，0. 1 g /L 時(shí)，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用; 與陽(yáng)性對(duì)照熊果苷相比，SPE 對(duì)黑色素含量和酪氨酸酶活性的抑制作用與熊果苷基本一致，表明 SPE 的美白效果與普遍認(rèn)可的美白添加劑熊果苷的效果一樣。

　　關(guān)鍵詞 水解貝殼硬蛋白; B16 細(xì)胞; 黑色素; α-黑素細(xì)胞刺激素; 酪氨酸酶

　　當(dāng)前化妝品領(lǐng)域，美白是消費(fèi)者追求的熱門(mén)話題，目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的美白活性物質(zhì)有熊果苷、曲酸、甘草提取物等。其中曲酸的副作用比較強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，長(zhǎng)期使用可能會(huì)致癌"：酪氨酸是一種廣泛存在于人體中的氧化酶2，它能把酪氨酸氧化成為多巴醒，再經(jīng)過(guò)一系列的生化過(guò)程，最終生成為黑色素四。黑素細(xì)胞中酪氨酸酶在黑色素的生成過(guò)程中起到催化作用，是主要的限速酶[，如果添加外界物質(zhì)在一定程度上抑制酪氨酸酶的活性，就可以減少黑色素的生成，起到美白的效果。熊果苷和甘草提取物的美白效果都是通過(guò)抑制酪氨酸酶活性，從而達(dá)到減少黑色素含量，最終起到美白效果[5]，這一類美白活性物質(zhì)比較受消費(fèi)者的喜歡。

　　a-MSH通過(guò)與黑色素細(xì)胞表面黑色素1受體(Melano-

　　cortin-l recptor，MC-R)的結(jié)合，促進(jìn)黑色素細(xì)胞樹(shù)突的形成、酪氨酸酶表達(dá)量增加以及活性增強(qiáng)、黑色素細(xì)胞的增殖，最終促進(jìn)黑色素的生成，因此在一些美白活性物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，a-MSH通常做為黑色素合成的刺激素。

　　珍珠主要由95%的碳酸鈣和5%的角殼蛋白組成回，通過(guò)對(duì)珍珠的深加工發(fā)現(xiàn)珍珠在美容方面具有美白、抗氧化等功效。如張麗華等[發(fā)現(xiàn)珍珠提取物具有很顯著的體外抗氧化能力;楊安全等"1發(fā)現(xiàn)珍珠提取物能抑制B16F10細(xì)胞的酪氨酸酶活性，且能減少黑色素的生成，說(shuō)明珍珠提取物有美白的效果。珍珠母和珍珠同源生長(zhǎng)，除碳酸鈣晶型有所區(qū)別外，其中的有機(jī)質(zhì)例如蛋白質(zhì)相似度較高，目前珍珠母中蛋白提取物的功效研究還沒(méi)有報(bào)道過(guò)，作者推測(cè)珍珠母提取物有和珍珠提取物相似的功效，本文以B16為受試細(xì)胞，采用CCK8法研究珍珠母中不同濃度的水解貝殼硬蛋白對(duì)細(xì)胞的增殖影響，初步研究了水解貝殼硬蛋白對(duì)酪氨酸酶活性以及黑色素含量的影響，為新一代美白化妝品原料的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，也為珍珠母的深加工開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

　　1材料

　　1.1 樣品來(lái)源

　　水解貝殼硬蛋白(SPE)：三角帆蚌貝殼于研磨機(jī)中研磨成粉，溶解后脫鈣取貝殼硬蛋白，進(jìn)行水解，過(guò)濾取上清液后凍干，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%~55%。

　　1.2 藥品與試劑

　　胎牛血清FBS，購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司;PBS緩沖液(pH =7.4)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;

　　0.25%胰蛋白酶(0.02%EDTA)，青鏈霉素溶液，DMEM培養(yǎng)液，均購(gòu)自杭州科易生物技術(shù)有限公司：CCK-8，Triton X-100，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;多巴溶液(L-DOPA)，熊果苷，均購(gòu)自阿拉丁;二甲基亞砜(DMSO)，乙醇，乙醚，氫氧化鈉，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

　　1.3儀器

　　酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司：C02培養(yǎng)箱(BB150)，-81 ℃冰箱，賽默飛世爾科技公司; 倒置顯微鏡( CKX41) ，奧林巴斯(中國(guó))有限公司。

　　1.4細(xì)胞株

　　B16黑色瘤細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)于上海中科院細(xì)胞所。

　　2方法

　　2.1 B16細(xì)胞的培養(yǎng)和分組

　　B16細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃.5%C02培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組(Con-

　　trol)，a-MSH模型組(Model)，陽(yáng)性對(duì)照組(a-MSH誘導(dǎo)+

　　熊果苷1.36 g/L)，SPE組(a-MSH誘導(dǎo)+SPE1，0.1 g/L)。

　　2.2 B16細(xì)胞活力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

　　采用CCK8法測(cè)定B16細(xì)胞的活力。取B16細(xì)胞調(diào)節(jié)至5 x 10個(gè)/mL，配成單細(xì)胞懸液，加入96孔板，每孔100 L，置于37 ℃.5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照分組加入不同藥物，每組6個(gè)平行，培養(yǎng)24 h后去上清液，用PBS清洗一遍，每孔加入100 uL培養(yǎng)液，再每孔加入10 ul CCK8溶液，放入培養(yǎng)箱作用2h后，在酶標(biāo)儀上，以雙波長(zhǎng)450 nm和650 nm測(cè)定各孔的吸光值。B16細(xì)胞的細(xì)胞存活率計(jì)算方法：

　　2.3 B16細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)[2

　　采用NaOH裂解法測(cè)定B16細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量。按照5 x 10"個(gè)/mlL.的細(xì)胞密度進(jìn)行6孔板接種，每孔加入2 ml，培養(yǎng)液，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后，按照分組加入不同藥物，每組3個(gè)平行，37 ℃，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄上清，使用胰酶消化收集細(xì)胞，加入300 L，1 mol/L NaOH(含10%DMSO)，于80℃水浴反應(yīng)40 min，使黑素顆粒完全溶解，收集到96孔板，每孔200 uL，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)405 nm處測(cè)各孔的吸光值。B16細(xì)胞內(nèi)黑色素含量抑制率計(jì)算方法：

　　2.4 B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)[3

　　采用L-DOPA氧化法測(cè)定B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性。按照5 x 10"個(gè)/ml.的細(xì)胞密度進(jìn)行96孔板接種，每孔加入100 山培養(yǎng)液，37 ℃，5%co2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后，按照分組加入不同藥物，每組6個(gè)平行，37℃，5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，用PBS洗滌3次，每孔加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X400)溶液50 L，迅速置于-81 ℃凍存30 min，隨后室溫融化使細(xì)胞完全破裂，37 ℃預(yù)溫5 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的L-

　　DOPA溶液10 L，37 ℃反應(yīng)2 h，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)其吸光值。B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性抑制率計(jì)算方法：

　　2.5 數(shù)據(jù)分析

　　數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism8軟件進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)差

　　(i±s)表示，用1Hest檢驗(yàn)差異的顯著性，P<0.05表示具有顯著性。

　　3結(jié)果

　　3.1 SPE對(duì)B16細(xì)胞活力的影響由圖1可知，B16細(xì)胞經(jīng)不同濃度的SPE(1，0.1 g/L)

　　作用24 h后，SPE對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響，與空白對(duì)照組相比(Control)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

　　因此表明，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可用這兩個(gè)濃度進(jìn)行研究。

　　3.2 SPE對(duì)a-MSH誘導(dǎo)的B16細(xì)胞黑色素含量的影響

　　由圖2可知，B16細(xì)胞經(jīng)過(guò)a-MSH的誘導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量明顯增加(P<0.05)，表明a-MSH誘導(dǎo)的細(xì)胞黑色素高表達(dá)量模型建立成功。與a-MSH模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照熊果昔作用后，細(xì)胞內(nèi)黑素含量明顯降低，生成抑制率為

　　(15.16 ±2.42)%：而SPE組，當(dāng)作用質(zhì)量濃度為1，0.1 g/L時(shí)，對(duì)黑色素含量的生成抑制率分別為(17.30±4.47)%

　　(11.88 1 10)%，與a-MSH模型組相比，具有顯著性差異

　　(P <0.05，P<0.01)。結(jié)果表明，當(dāng)SPE質(zhì)量濃度為1g/L時(shí)對(duì)黑色素生成抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照熊果苷基本一致。

　　3.3 SPE對(duì)a-MSH誘導(dǎo)的B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

　　由圖3可知，SPE和陽(yáng)性對(duì)照熊果苷對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性都呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。a-MSH模型組相比，SPE在1，0.1 g/L時(shí)，酪氨酸酶活性的抑制率分別為

　　(15.96 ±6.72)%、(23.90 ±8.45%);而陽(yáng)性對(duì)照熊果苷的抑制率為(23.86±7.04)%。結(jié)果顯示，SPE對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照熊果苷基本一致。

　　4討論

　　研究以B16細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建a-MSH誘導(dǎo)細(xì)胞的黑色素高表達(dá)量細(xì)胞模型。首先研究SPE對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，SPE在質(zhì)量濃度為1，0.1 g/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，具有較高的安全性，可用這兩個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。以熊果苷為陽(yáng)性對(duì)照，本研究檢測(cè)了SPE對(duì)a-

　　MSH的細(xì)胞內(nèi)黑色素含量及酪氨酸酶活性的影響。結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)a-MSH的誘導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)黑色素含量和酪氨酸酶活性明顯增加，與空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異，表明a-MSH誘導(dǎo)的細(xì)胞黑色素高表達(dá)量模型建立成功。SPE對(duì)a-MSH誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)黑色素含量和酪氨酸酶活性均有抑制作用，與陽(yáng)性對(duì)照熊果苷相比，SPE對(duì)黑色素含量和酪氨酸酶活性的抑制作用和熊果苷基本一致。研究中SPE主要通過(guò)抑制酪氨酸酶的活性來(lái)起到降低黑色素的含量，至于SPE的具體成分分析、具體哪種成分在起作用以及具體通過(guò)哪種信號(hào)途徑起到降低黑色素的含量，這些問(wèn)題在今后的研究中會(huì)繼續(xù)挖掘。研究表明，SPE作為一種化妝品原料，在一定濃度范圍內(nèi)具有一定的生物安全性，其美白效果與普遍認(rèn)可的美白添加劑熊果苷基本上一致。

　　參考文獻(xiàn)

　　[1] You A, Zhou J, Song S, et al. Rational design , synthesis and structure-activity relationships of 4-alkoxy-and 4-acyloxyphenylethyl enethiosemicarbazone analogues as novel tyrosinase inhibitors LJ]. Bioorganic Med Chem, 2015, 23 (5) :924931.

　　[2] Kubo I, Kinst-Hori I, Kubo Y, et al. Molecular design of antibrowning agents [J]. J Agricul Food Chem, 2000, 48 (4):13931399.

　　[3] Seo SY, Sharma VK, Sharma N. Mushroom tyrosinase: recent proSPEcts [1] .J Agricul Food Chem, 2003,51 (10) :28372853.

　　[4] J. P Césarini, I. N S E R M. Melanins and their possible roles through biological evolution [J] . Advances Space Res, 1996, 18(12) :35-40

　　[5] Chakraborty AK, Funasaka Y, Komoto M, et al. Effect of arbutin on melanogenic proteins in human melanocytes [J]. Pigment Cell Research, 1998,11 (4) :206-212.

　　[6] Sturm RA, Teasdale RD, Box NF. Human pigmentation genes: identification, structure and consequences of polymorphic variation[J]. Gene, 2001 , 277 (1) :49-62.

　　[7]Suzuki 1，Cone RD，Im S，et al.Binding of melanotropic hormones to the melanocortin receptor MCI R on human melanocytes stimulates proliferation and melanogenesis[J].Endocrinology，1996，13(5)：16274633.

　　[8]Moragot Chatatikun，Takeshi Yamauchi，Kenshi Yamasaki，et al.Phyllanthus acidus(L.)Skeels and Rhinacanthus nasutus(L.)Kurz leaf extracts suppress melanogenesis in normal human epidermal melanocytes and reconstitutive skin culture[J].Asian Pacific J Tropical Med，2019，12(03)：98405.

　　[9]楊明月，郭守國(guó)，史凌云，等，淡水養(yǎng)殖珍珠的化學(xué)成分與呈色機(jī)理研究[J].寶石和寶石學(xué)雜志，2004，(02)：10-43.

　　[10]張麗華，沈玥琦，楊安全，等，珍珠提取物凍干粉的體外抗氧化功效研究[].香料香精化妝品，2018，(04)：2629.

　　[11]楊安全，王菁，沈玥琦，等，珍珠提取物對(duì)黑色素細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑色素合成的影響[].藥物生物技術(shù)，2018，25(04)：312-315.

　　[12]Nouha Nasr Bouzaiene，F(xiàn)adwa Chaabane，Aicha Sassi，et al.Effect of apigenin-7-glucoside, genkwanin and naringenin on tyrosinase activity and melanin synthesis in B16F10 melanoma cells [J]Life Sciences, 2016, 144.

　　[13] Kim A, Yim NH, Im M, et al. Ssanghwa-tang, an oriental herbal cocktail, exerts anti-melanogenie activity by suppression of the 38 MAPK and PKA signaling pathways in B16F10 cells [J]Bmc Complementary Alternative Med, 2013, 13 (1) :214.