摘要：為了解發酵培養料制備過程中微生物代謝產物的組成和變化規律，采用非靶向代謝組學技術，檢測分析發酵2、4、6、8和10d時培養料的代謝組數據。結果表明：在正離子(POS)模式下，分別在T2vsT1、T3vsT2、T4vsT3和T5vsT4中篩選得到331、145、161和115種差異代謝物;在負離子(NEG)模式下，分別篩選得到251、159、106和76種差異代謝物。這些差異代謝物主要包括糖類及其衍生物、氨基酸、肽類及其類似物、脂肪酸類、維生素類、苯丙素類和聚酮類物質及其他次級代謝產物。此外，在發酵培養料中還含有植物生長調節劑(如吲哚-3-乙酸、茉莉酸和赤霉素)和抑菌物質(如綠原酸、抗生素、白藜蘆醇)。該研究可為制備質量穩定的發酵培養料和掌握發酵培養料栽培平菇技術提供參考。

　　關鍵詞：平菇;發酵料;代謝組學;差異代謝物

　　平菇Pleurotusostreatus(Jacq.)P.Kumm.，是世界上栽培最廣泛的食用菌之一[1-3]，也是重要的食藥用真菌[4-5]。平菇的栽培技術主要有3種：生料栽培、熟料栽培和發酵料栽培[6]。與生料和熟料栽培相比，發酵料栽培平菇由于具有低污染、低成本、工藝簡單和經濟效益高的優點而在世界范圍內得到了廣泛應用[6]。

　　發酵論文范例：復合蛋白發酵酸奶飲料的穩定體系研究

　　平菇栽培用發酵料是以秸稈、玉米芯等農業副產物為主要原料，加入少量的麩皮、石灰等，在微生物的參與下，經短期、好氧發酵而制備的[3]。玉米芯約占玉米產量的21%，是一種產量巨大的農副產品，來源廣泛、價廉易得[7]。目前，玉米芯除用于制備糠醛、木糖醇等外，很大一部分被作為農業廢棄物直接燃燒，造成資源浪費和環境污染。

　　玉米芯組織均勻、硬度適宜、吸水性強，將其堆制發酵后用于平菇栽培，不僅有助于平菇產量和品質的提高，而且可以實現農業副產物的高效生物轉化[8]。筆者在前期的研究中發現：平菇玉米芯發酵培養料制備過程中，變形菌門Proteobacteria在早期階段(T1)占優勢(相對豐度35.67%~44.10%)，在高溫階段(T2，T3)，厚壁菌門Firmicutes成為新的優勢門(相對豐度41.50%~48.52%)，而在堆肥后期(T4、T5)，變形菌門重新成為優勢門(相對豐度33.55%~36.89%)[9]。這些微生物對發酵過程中植物秸稈中木質纖維素的降解起著至關重要的作用。

　　Pearson相關分析表明，發酵培養料制備過程中的理化性質變化與其中微生物菌落的組成變化顯著相關[9]。微生物能將培養料中復雜的有機質(纖維素、半纖維素、木質素等)進行降解，使其變成簡單、易于利用的低分子物質;有些特定微生物如Actinobacteria、Thermus和Bacillus還可以產生抗菌、殺蟲的物質，這可能是發酵培養料栽培平菇可以采用開放式接種的原因之一[10]。

　　目前對玉米芯發酵培養料的研究主要集中在栽培平菇[11-13]和制備過程中發酵培養料中微生物及其功能的演替方面[3]，而對玉米芯發酵培養料制備過程中微生物代謝產物的研究還未見報道。代謝組學(metabolomics)是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學后出現的新興組學技術，是系統生物學的重要組成部分[14]。代謝組學是從整體角度出發，運用現代檢測技術對盡可能多的代謝產物進行分析檢測[15]。

　　目前，代謝組學在真菌領域的應用也日益廣泛，為人們提供了一個了解真菌代謝的獨特途徑[14-16]。因此，筆者通過采用非靶向代謝組學技術分析檢測玉米芯發酵培養料制備過程中發酵微生物代謝產物的種類和含量，進而探討制備過程中主要代謝物的組成及變化規律，為穩定發酵料質量提供理論基礎。

　　1材料與方法

　　1.1發酵料發酵料的質量分數配比為：玉米芯84%，麩皮10%，石灰5%，尿素1%;含水量68%。

　　1.2試劑與儀器玉米芯(中值粒徑0.5cm)、麩皮、石灰、尿素均購自本地農貿市場;LC-MC級甲醇、水、甲酸、醋酸銨(CNWTechnologiesGmbH,Germany)。BSA124S-CW天平(Sartorius);1290UHPLC色譜儀(AgilentTechnologiesInc.,USA);TripleTOF6600質譜儀(ABSciexPte.Ltd.,USA);D3024R高速冷凍離心機(Scilogex,USA);JXFSTPRP-24全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業發展有限公司);GWB-1普析純水儀(北京普析通用儀器有限責任公司);KS-7200DV超聲儀(昆山潔力美超聲儀器有限公司)。

　　1.3發酵料制備和取樣

　　該試驗于2020年3—4月在河南省農業科學院現代農業科技試驗示范基地進行。根據以往的報道[12]，制備平菇發酵料。發酵料制備試驗包含6個重復，每個重復包含250kg原料(干質量)。

　　玉米芯原料按照質量比為1∶2.4~2.5的料水配制，機械攪拌30min，堆置1d后進行建堆，堆高60cm，寬1.5m左右，長度不限。此時培養料的含水量約為70%，pH值9~10，顏色為金黃色。用直徑5cm的木棒在料堆上部、橫豎間隔30~40cm打通風孔，木棒要求插到料堆底部。發酵周期為10d，第3天溫度升至45~55℃開始翻堆，培養料溫度升至70℃以上每隔1d翻堆1次，共4次，直至發酵完成。分別在發酵2、4、6、8、10d時采集樣品，標注為T1、T2、T3、T4、T5。為了獲得具有代表性的樣本，分別從發酵料堆的9個不同位置采集子樣本，然后將子樣本進行混合得到一個樣本[3]。

　　1.4代謝組學分析

　　取發酵培養料樣品進行代謝組學分析，按北京諾禾致源科技股份有限公司非靶向代謝組學分析方法提取代謝物、超高效液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜(ultraperformanceliquidchromatography-quadrupoletime-of-flightmassspectrometry，UPLC-QTOF-MS)分析代謝物，采用ProteoWizard和XCMS軟件對代謝組下機數據(.raw)實施峰的識別、提取、積分及對齊等處理。

　　利用mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和Masslist數據庫進行峰比對，同時采用blank樣本去除背景離子，進一步進行峰面積的批次歸一化和自適換算標準化處理，從而得到代謝物的鑒定和定量結果。采用SIMCA軟件(version14.1，sartoriusstedimdataanalyticsAB，Umea，Sweden)對數據進行主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis，OPLS-DA)[17]。

　　2結果與分析

　　2.1發酵培養料代謝物的主成分分析

　　基于非靶向代謝組學技術對發酵2、4、6、8、10d的培養料樣品進行檢測，分別在正離子(POS)和負離子(NEG)模式下鑒定得到1208和472種代謝物，對所有代謝物進行PCA分析。培養料樣品中的代謝物分成5組，組內樣本均集聚良好，這說明5組培養料樣品的微生物代謝物具有顯著的差異。為更充分地提取不同發酵時期培養料樣品中代謝物的差異信息，分析篩選不同組間的差異代謝物，因此進一步采用有監督的OPLS‐DA分析數據。

　　T2vsT1、T3vsT2、T4vsT3、T5vsT4中的樣品點均分布在不同的區域且明顯分為兩個簇，實現了兩組樣品間的完全分離。結果表明，不同發酵時期培養料樣品中微生物代謝產物在種類和(或)含量上存在明顯差異。

　　POS模式下T2vsT1、T3vsT2、T4vsT3、T5vsT4的OPLS‐DA模型質量參數分別為：R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00，R2Y(cum)=0.98;R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.95。NEG模式下分別為：R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.99;R2Y(cum)=1.00，Q2Y(cum)=0.98;R2Y(cum)=0.99，Q2Y(cum)=0.97。R2Y和Q2Y均大于0.5，這表明依據兩種采集模式所得數據建立的OPLS‐DA模型都具有較好的擬合性和較強的預測能力。

　　3討論與結論

　　筆者在本研究中采用非靶向代謝組學技術對不同發酵時期的平菇培養料中的代謝物進行分析，差異代謝物總數最多的是T2vsT1，其次是T3vsT2，最少的是T5vsT4。這與筆者前期對5個發酵時期培養料中微生物的代謝功能差異的分析結果基本一致[3]。發酵培養料中的漆酶、木聚糖酶和蛋白酶活性峰值出現在發酵降溫階段[3]，表明木質纖維素和蛋白質的分解主要是在發酵后期發生，因此T2vsT1和T3vsT2時糖類及其衍生物和氨基酸、肽類及其類似物相對含量顯著下降。

　　這可能是因為發酵前期(T2和T3)微生物代謝旺盛，需要大量的糖類和氨基酸以滿足其生長和繁殖所需，導致T2和T3時發酵料中的糖類和氨基酸含量均較發酵前一時期(T1和T2)有所下降;到發酵后期(T4和T5)，木質纖維素降解酶和蛋白酶活性大幅升高， 大量木質纖維素和蛋白質被降解生成低分子糖、肽類和氨基酸，因而其含量均比發酵前一時期(T3和T4)有所增加。發酵料中的Actinobacteria、Thermus和Bacillus屬的微生物具有產生抑菌物質的能力[18]。

　　發酵料中的抑菌物質含量隨發酵進程逐漸增加，為后期平菇開放式接種創造了良好的條件。這與筆者前期研究結果一致，隨著發酵時間的延長，發酵料浸提液對青霉和木霉的抑制作用也隨之增強[19]。維生素可以作為輔酶因子參與多種重要的生化反應，是生物不可或缺的生長因子。不同微生物之間可能憑借維生素的種間傳遞而建立相互作用關系，對微生物群落結構形成和功能發揮起著重要作用[20]。與抑菌物質含量變化趨勢相似，發酵培養料中的維生素含量也較發酵前一時期有所增加。

　　在自然界中，木質纖維素可以被微生物分解成低分子的芳香族化合物，如水楊酸、阿魏酸等[21-22]。與T1相比，T2時期發酵培養料中的苯丙素類和聚酮類物質相對含量明顯下降，這可能是因為微生物優先利用易降解的低分子物質，而T3、T4和T5時的苯丙素類和聚酮類物質相對含量分別比發酵前一時期有所增加，隨著發酵的繼續，玉米芯中易于降解的物質被利用完，微生物開始降解復雜高分子物質如木質素和酚類物質，進而生成了較多的低分子苯丙素類和聚酮類物質。

　　研究表明，植物生長調節劑如吲哚乙酸、赤霉素、脫落酸可以促進平菇菌絲的生長[23-24]。筆者前期研究發現，T5時期發酵培養料浸提液對平菇菌絲生長促進作用最為明顯，尤其是體積分數為80%時，平菇菌絲生長速度和生物量分別比對照增加0.53cm·d-1和0.179g[25]。這可能與發酵培養料中的植物生長調節劑如脫落酸、吲哚-3-乙酸和赤霉素的相對含量均在發酵后期達到最高值有關。綜上所述，不同發酵時期的玉米芯培養料中的微生物代謝產物具有明顯的差異，并且其中含有豐富的抑菌物質和植物生長調節劑。該研究為平菇栽培獲得穩定的發酵料質量提供了科學依據和理論基礎。

　　參考文獻

　　[1]NAMWL，SUMH，PHANGXY，etal.Productionofbio-fertilizerfrommicrowavevacuumpyrolysisofpalmkernelshellforcultivationofOystermushroom(Pleurotusostreatus)[J].ScienceofTheTotalEnvironment，2018，624：9-16.

　　[2]JAYASINGHEARACHCHIHS，SENEVIRATNEG.Canmushroomsfixatmosphericnitrogen[J].JournalofBiosciences，200429(3)：293-296.

　　[3]KONGWL，SUNB，ZHANGJY，etal.MetagenomicanalysisrevealedthesuccessionofmicrobiotaandmetabolicfunctionincorncobcompostingforpreparationofcultivationmediumforPleurotusostreatus[J].BioresourceTechnology，2020，306：123156.

　　[4]戴玉成，楊祝良.中國藥用真菌名錄及部分名稱的修訂[J].菌物學報，2008，27(6)：801-824.

　　[5]SÁNCHEZC.CultivationofPleurotusostreatusandotherediblemushrooms[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2010，85(5)：1321-1337.

　　[6]HERNÁNDEZD，SÁNCHEZJE，YAMASAKIK.AsimpleprocedureforpreparingsubstrateforPleurotusostreatuscultivation[J].BioresourceTechnology，2003，90(2)：145-150.

　　作者：劉皓皓1，劉芹2，崔筱2，靳榮線3，高玉千1，李亞楠1，孔維麗2，裴瑞杰4，邱立友1