摘要 細菌是一種單細胞生物, 在自然環境中具有群體特征與組織化特性. 群體感應信號(quorum sensing, QS)是細菌適應環境變化、調控基因表達和協調群體行為的通訊語言. QS系統廣泛存在于各類微生物(細菌、真菌、古菌)并調控多種生理行為, 包括生物發光、生物被膜(biofilm)的形成、毒力因子的產生和共生關系的建立等. 然而,鑒于自然界中微生物群落結構的多樣性和功能的復雜性, QS介導下的調控網絡和生態機制依然存在未知領域.近年來, 合成生物學的蓬勃發展為認識QS效應提供了新的契機. 合成生物學在設計遺傳元件庫、組裝生物裝置、設計遺傳電路和創建預見性群落行為等方面取得了卓越的研究成果; 該方法也為研究QS在調節微生物群落的組成和功能上提供了重要工具. 鑒于此, 本文嘗試對最新的進展作一綜述. 首先介紹了QS系統及其主要功能作用和信號傳導途徑; 其次, 討論了如何利用合成生物學來設計QS過程信號通路和遺傳電路, 并減少感應通路的串擾; 最后, 評估了合成感應系統的方法以及該方法在微生物種內和種間通訊中的表現. 本文旨在梳理合成生物學的先進理念, 加深對基于微生物QS系統構建計算工具、調控種群密度和代謝流等方面的理解, 拓展合成生物學手段操縱QS領域的應用范圍.

　　關鍵詞 群體感應, 合成生物學, 信號通路, 遺傳電路, 合成菌群

　　自然界中細菌與其他微生物, 如真菌、古菌和病毒等, 形成了一個復雜且動態的微型生態系統[1]. 該系統的每個物種都占據一定的生態位, 共同參與資源競爭和代謝活動, 發揮各自的生理功能并最終構成相對穩定的生態網絡[2]. 群體感應(quorum sensing, QS)是微生物分泌的一類代表性化學感應信號, 負責協調基因表達、控制細胞密度和調節表觀行為等生理過程.在應對多變的外界環境時(生物和非生物因素), QS起著調節群體行為、響應環境刺激和維持生態平衡的作用.目前已報道的QS信號分子主要有三類: AI-1型高絲氨酸內酯(acyl homoserine lactone, Acyl-HSL)、AI-2型自誘導物-2(autoinducer-2)和寡肽類分子(autoinducing peptides, AIP).

　　信號交流的過程通常是細胞外和細胞內多種信號的整合[3], 當信號物質濃度達到臨界閾值時被細胞所感知, 激活或抑制下游目標基因[4~6]引發相應的生理反應, 如分泌毒力因子、形成生物被膜(biofilm)、啟動群集運動及刺激生物發光等[7,8]. 該機制廣泛存在于各種微生物, 目前已經明確鑒定的有超過100種細菌可以通過QS調節基因的表達; 以模式菌株銅綠假單胞菌(Pseudomona aeruginosa)為例, 其整個基因組超過6%的基因受QS信號調控[9]. 早期的QS研究主要針對實驗室條件下純培養的單個菌株[10,11],通過對QS的促進或抑制來實現一些目的, 其中對前者的應用主要是增加微生物代謝產物的產量(如酶類、蛋白、工農業化合物等), 對后者的應用集中于抑制有害菌的數量或繁殖(如病原菌、生物污損、牙斑垢等).然而, 單一菌種培養物存在產物不純、功能障礙以及調控不精準等問題.

　　例如, 利用純培養技術生產二元醇時, 會出現培養物成分復雜, 而難以分離純化出目標產物的問題[12]; 由單菌發酵獲得的生物活性酶, 當經歷異源蛋白過表達導致的代謝紊亂后, 其活性功能會嚴重受阻[13]. 此外, 面對動態而復雜的自然環境, 傳統的QS應用手段面臨著效應劑量、生態安全、操控效率等巨大挑戰. 為了彌補上述不足, 一些新型手段相繼出現, 其中自誘導系統的合成是最早應用的方法之一, 它借助于自誘導培養基及其底物, 誘導目標菌相關酶的過量表達, 無需加入額外的誘導劑, 就能實現高通量篩選多種培養物的目的, 獲得目標產物的高產能力[14], 這也被視為合成生物學的雛形.合成生物學是一門致力于從零開始重塑生物基因組的學科. 與基因工程的序列修飾、植入、基因缺失、重組以及堿基移植的做法不同, 合成生物學的目的在于建立人為可操控的底盤系統, 讓它們像電路一樣運行. 其核心是從最基本的要素開始, 通過零部件的構建和組合來改造自然生命[15]. 簡單地說, 合成生物學研究內容大體涵蓋三個層次:

　　一是利用已知功能的天然生物模塊(module)構建新型調控網絡并展現出新功能[16]; 二是采用從頭合成的方法構建基因組DNA并重構生命體; 三是在前兩個領域的基礎上, 創建完整的全新生物系統乃至人工生命體[17]. 合成生物學和系統生物學有相似的邏輯關系, 可以看作是后者在技術層面上的拓展, 因此也稱其為“工程生物學”[18], 有人預言合成生物學將是21世紀新一輪的工業革命[19,20].在QS領域, 合成生物學能利用DNA從頭合成的特性和不依賴于現有自然模板的優勢, 對QS系統的行為和過程進行特定功能的元件構造、遺傳電路合成和菌群搭建. 組裝基于QS的合成電路系統, 進而實現調控菌群的群體功能, 這一策略不僅為揭示QS機制提供了有效手段, 而且有望通過操控QS系統達到特定目標.前期針對改造QS系統來調控菌群行為進行過一些嘗試. 例如, 在兩株大腸桿菌(Escherichia coli)間建立QS雙向通訊, 通過調控細胞自殺基因的表達水平來模擬微生物之間的捕食或寄生關系[21]; 利用QS分子-球菌肽(nisin)的模塊化模擬乳酸球菌(Lactococcus lactis)的相互作用模式[22].

　　近年來, 隨著合成生物學的高速發展, 該技術在QS領域的應用也飛速進步.近年來, 許多學者對不同種模式細菌的QS元件作了詳細的總結和論述, 包括QS信號分子、基因表達通路和QS通訊網絡[6,23]; 也有學者重點關注微生物群落的QS在環境中的作用, 討論人為和環境因素對QS調節過程的影響[24], 及QS調節和響應機制[10]. 此外, 還有文獻重點強調了如何拓展和延伸QS的研究和應用領域[9]. 但合成生物學手段應用于群感系統的總結還不多見. 事實上, QS系統具有很強的可塑潛力, 這使得它成為生物工程或分子編輯技術的理想靶標. 為此, 本文以近十年的文獻為重點, 嘗試總結合成生物學用于QS研究的一些重要策略, 包括正向調控、負向調控、種內通訊和種間通訊等, 并對合成生物學構建和調控菌群的應用研究進行歸納, 旨在更深入地明晰合成生物學的魯棒性并拓展其應用領域的范圍.

　　1 微生物的QS通訊系統

　　QS信號始于對海洋烏賊共生微生物費氏弧菌(Vibrio fischeri)的研究[25], 該菌的生物發光依賴LuxI/LuxR感應元件對信號分子的響應[26]. Nealson等人[27]鑒定出這類信號分子為酰基高絲氨酸內酯(acylated homoserine lactone, AHL), 一種由LuxI家族合成酶催化合成的自誘導劑(autoinducer, AI).

　　當AHL分子濃度達到閾值時會結合細菌表面或細胞質的受體, 進入細菌體內與LuxR的調控因子結合, 形成LuxI/LuxR復合系統, 作為分泌AHL信號分子的供體和受體[28].LuxI/LuxR編碼的AHL分子是最經典和最廣泛存在的QS物質, 也是介導革蘭氏陰性菌QS系統主要的自誘導物[29], 如銅綠假單胞菌、耶爾森氏菌(Yersiniaspp.), 大腸桿菌E. coil和洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)等. 細菌的QS系統并非單一的信號通路,而是有組織的復雜集合. 截至目前, 在銅綠假單胞菌中報道了三種不同屬性的QS分子系統, 即LuxI/LuxR, Las和Rhl通路, 分別編碼酰基高絲氨酸內酯、3-氧十二烷酰高絲氨酸內酯(3-oxo-C12-HSL)和正丁醇基高絲氨酸內酯(C4-HSL)[30].

　　此外, 一些革蘭氏陰性菌也被發現能利用擴散信號因子(diffusible signaling factors,DSF)進行交流[31~33].與革蘭氏陰性菌不同, 革蘭氏陽性菌既不合成AHL, 也不受LuxI-LuxR系統的控制, 而是由膜表面傳感器和細胞內反應調節其組成的雙組分信號轉導系統(two-component system, TCS)所調控. 革蘭氏陽性菌通過分泌自誘導肽, 并與膜上組氨酸激酶AgrC受體結合, 在AgrA調節蛋白的作用下激活P2/P3啟動子產生RNAIII, 促使AgrD酶合成自誘導肽AIP,從而控制基因表達[34].AHL和AIP是AI-1型系統的典型代表, 分屬于革蘭氏陰性和陽性細菌, 目前AI-1型多集中于種內的信息通訊.

　　對于種間通訊, AI-2較為常見[35,36], 該系統同時存在于兩類細菌. 大腸桿菌、弧菌(Vibrio)以及傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的基因組都含有編碼AI-2型的LuxS酶序列, 這些細菌的LuxS酶能催化S-核糖同型半胱氨酸(S-ribosyl-homocysteine, SRH)和S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine, SAM)(一種AHL的合成前體)發生裂解, 產物經重排和修飾后形成AI-2,并與細菌表面受體LuxP/LsrB結合引發信號轉導的級聯反應[37,38].

　　以大腸桿菌為例, 胞內的AI-2經LsrK激酶磷酸化后, 與LsrR結合并激活雙向Lsr啟動子, 使LsrACDB和LsrK過表達, 加速細胞對胞外AI-2信號分子的結合與感應. 除了上述常見的AI-1和AI-2型信號分子, Hossain和Boon[39]還發現了一種新的信號通路, 即一氧化氮(NO)結合蛋白(NO/NosP), 這一通路主要見于銅綠假單胞菌, 其通過對低水平的NO產生應答來調節菌群行為.與原核生物(細菌)常見的信號分子相比, 真核生物(真菌)的QS信號在21世紀初才被發現[40]——最先在白色念珠菌(Candida albicans)中發現一種調節種內通訊的信號分子, 即金合歡醇(farnesol), 它能控制白色念珠菌絲狀體的形成, 使其在酵母和菌絲兩種形態間相互轉換. Leonhardt等人[41]探究了白色念珠菌的侵染機制, 發現金合歡醇介導了白色念珠菌與宿主細胞的交流, 并作為毒力因子活化人體先天免疫細胞來增加炎癥反應.

　　此外, 已鑒定的真菌QS信號分子還有金合子酸(farnesoic)、對羥苯基乙醇(tyrosol)、苯乙醇(phenylethanol)和β-吲哚乙醇(tryptophol)[40]. 對于合成機制的解析, 目前研究相對清楚的是新生隱球菌(Cryptococcus neoformans). 該菌擁有寡肽Qsp1通路,被認為是真正意義上的真菌QS系統[42](圖1A). Qsp1信號分子介導的QS過程, 包括前肽Qsp1的合成、蛋白酶Pqp1的裂解以及Qsp1分子的成熟, 組裝完整的信號分子經寡肽轉運體Opt1再次進入細胞, 啟動級聯反應并觸發信號轉導. 目前的研究發現, 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)和粗糙鏈孢菌(Neurospora crassa)的微摩爾級的信號分子就能發生級聯反應, 且介導的代謝途徑具有種屬差異.

　　鑒于QS信號在微生物中的重要性, 人們已通過它揭示了多樣的生物學機制, 包括毒力因子的產生、微生物被膜的形成、好氧活性污泥的形成機理、共生關系和協同進化的建立等[43]. 同時也獲得了多方面的應用, 包括馴化QS菌群處理工業廢水, 使用QS抑制劑防治海洋污損, 開發細菌生物被膜抑制物用于限制病原體感染擴散等[44]. 這些都表明QS具有廣泛的應用前景, 且對其深入的挖掘和拓展仍在不斷更新中. 在此背景下一些新的技術相繼涌現, 如合成生物學. 該技術作為一種新興方式, 近年來在QS領域展現出強勁活力, 并取得了一些革命性成果. 概括來講, 合成生物學用于QS的策略(圖2)旨在圍繞其核心“設計-構建-測試學習”的方法, 主要有正向/逆向調控、種內調節(邏輯門) /種間調節(振蕩調節、生物傳感器和數學建模)[45,46]及微生物之間的互作網絡與功能預測的輸入/輸出等.

　　2 合成生物學研究QS系統的理論策略

　　2.1 合成QS信號通路和基因電路(正向調控)

　　感應元件的構建是確保感應過程的前提, 理論上講, 不同的QS調控元件能構成邏輯線路, 調控菌群的感應過程. 這使得合成生物學可針對性地設計和修飾QS元件, 實現基于密度調控的遺傳電路和細胞間通訊.在進行基于合成生物學的QS研究前, 可以根據細胞代謝途徑構建數學模型, 確定聚焦的細胞表型與反應機制; 隨后利用細菌中的雙組分調節系統(two-component regulatory systems, TCRS)組裝遺傳電路[47,48].

　　借助逆啟動子和TCRSs的耦合傳感, 實現合成生物學對基因表達的調控, 從而對某些通路和遺傳電路進行優化. 最初, 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)合成遺傳電路的建立, 開啟了合成生物學設計QS細胞特定基因表達元件的先河, 創造了新的調控方式, 目前該編輯方法已廣泛應用于污染物的降解[49]. 隨后, Hauk等人[50]開發了基于大腸桿菌AI-2型QS的同源合成遺傳電路, 用于調節人源巨噬細胞刺激因子的表達, 實現了對外源和內源基因的同步控制. Hwang等人[21]針對銅綠假單胞菌產生的AHL信號分子, 設計了一種新的合成遺傳電路, 使工程型大腸桿菌獲得了可以靶向捕捉和殺死銅綠假單胞菌的能力.

　　自誘導物AI的合成是正向調控的典型代表, 因為它屬于遺傳電路中的輸入信號, 且具有在液體介質或細胞表面自由擴散的能力.除了合成自誘導元件, 建構理想的合成共培養物也是正向調控的方式之一. Malone等人[51]合成了達到流式細胞生物膜實驗要求的共培養物——AIP信號分子, 其可控制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Agr信號通路活性, 揭示了Agr系統對生物膜的擴散能力[52]. Marchand和Collins[53]根據Agr類信號系統的原理, 借助共培養技術分離得到了感應AIP信號的細胞, 建立了革蘭氏陽性菌巨型芽孢桿菌(Bacillus megaterium)種內感應信號通路[54]. 這些例證表明, 合成生物學在設計、模擬和編輯QS信號過程中有從上往下的調控潛力.

　　2.2 減少感應通路的串擾和擴展

　　正交通路(負向調控)與源頭開始的正向調控不同, 負向調控主要是解決下游途徑過程中的障礙, 如減少QS的過程串擾. 合成生物學在開發多個通路和設計多細胞系統時, 往往會受到不可預見的QS系統串擾的影響, 而系統內部信號、啟動子及兩者之間存在的不同程度的串擾也會造成通路和系統功能的喪失[55], 這就限制了QS成分在合成電路和合成菌群中的廣泛使用. 常用于合成遺傳電路的AHL信號通路, 包括Lux, Las和Rhl系統, 它們之間均表現出一定的串擾現象. 此外, OdDHL和HSL這兩種信號都能結合LuxR, 且均能驅動對應啟動子的轉錄和表達, 信號和啟動子串擾的同時發生增加了合成生物學的設計難度和操控難度.基于自然界中串擾的客觀存在, Wu等人[56]首先利用實驗證實了這一點. 他們將合成生物學和數學建模相結合, 研究了LuxI和LasR在單應變系統中的相互作用, 證實了細菌QS系統本身就存在LuxI和LasR之間低水平的串擾, 觀察到了QS串擾產生的復雜行為.

　　為此,如何有效地減少感應通路的串擾問題就顯得非常重要. Brenner等人[57]首次建立了大腸桿菌雙向細胞間的通訊網絡, 有效減緩了串擾的發生; 隨后Pai等人[58]利用銅綠假單胞菌的LasRI和RhlRI系統在兩個種群間進行雙向通訊, 進一步降低了系統之間的串擾等級, 最大限度地保持了種群的一致感應.除了規避串擾, 提升應對復雜環境變化的能力也是需要考慮的問題, 這一目標的實現通常需要多個信號通路的組合. 其中, 正交QS通路是最關鍵的一環, 通路的正交性體現在對合成電路表達的宿主細胞具有特異性且獨立調控的基礎上[59], 它是實現對活細胞信號做出反應的工具, 也使混種培養中細胞自主代謝調控成為可能.

　　正交QS通路最常用的方式是肽信號, 它在具備高信息含量的同時也有效地規避了串擾的產生.大腸桿菌和巨型芽孢桿菌正交合成通信系統的開發,是基于金黃色葡萄球菌Agr QS系統的AIP肽類信號進行的[53], 這種正交設計提升了應對復雜環境的能力,同時也避免了串擾的發生. 此外, Scott和Hasty[60]通過修飾Rra和Tra的啟動子和受體蛋白, 消除了兩個通路之間的信號和啟動子的干擾, 將其與已經得到廣泛應用的lux和las進行組合, 實現了系統中各條通路的正交搭配, 可用于更復雜菌群功能的調控, 還可在此基礎上誘導出新的正交系統.

　　不同物種間QS正交通路的開發, 有助于增加合成群落中物種的數量. Kylilis等人[61]分析了6種酰基高絲氨酸內酯的正交性, 結果表明, 該方法能有效地對多種細菌的基因表達進行調控. 此外, 沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)產生的QS分子與大多數細菌的QS系統, 包括Lux, Las, Tra, Rhl和Cin通訊途徑都具有正交性, 這為擴大正交分子建立新的合成通路提供了理論依據[62]. Martins等人[63]利用正交的QS分子建立了3個種群之間的通信, 建模實驗驗證了合成正交通路的可行性. 合成生物學設計QS系統主要是依賴于信號分子, 而信號分子在時間和空間上具有自組織特性, 往往不受人工控制. 為了解決這一問題, 將外源誘導劑與QS通路結合, 可幫助在單細胞水平和種群水平實現精準協調[62]. 總之, 誘導QS系統可將更多物種和正交通路進行優化, 編碼特定基因, 使人工設計的多細胞系統得到更遠程的控制和更廣泛的應用.

　　2.3 分子通訊評估

　　合成感應電路的性能QS是細菌通訊的一種形式, 合成生物學利用這一組合的元件構建了許多典型的基因電路, 包括基于QS的周期振蕩器、觸發開關和邏輯門. 隨著新的基因電路的不斷增加, 擴展了更多復雜的合成QS菌群和通訊網絡, 但這些合成感應電路的可靠性需要仔細評估. 在眾多的評價參數中, 信道容量是評價所有通信系統性能的一項重要指標, 它是指在特定情況下系統所能輸入和輸出的最大信息量.

　　一種基于細菌的分子通訊方法——雙端模型, 通過分析由3個菌群構成的合成邏輯電路的質量和信道容量, 對合成感應電路的性能進行了有效評估[63]. 該模型是一個集成的合成電路, 由上級通路完成產生的信號激發下級通路的運行, 該模型借助納米級的膜, 在水環境中只允許兩個輸出端的信號分子通過, 這樣就能使不同信號結合的多種細菌并行結合特定的信號[63]. 合成通信系統的質量決定了QS過程的發展方向和感應電路的性能. 在細菌的合成邏輯門中, 系統接收環境信號作為分子輸入, 通過一系列合成遺傳電路和自由擴散的通道作為分子輸出[62,64]. 在這一過程, 環境分子信號的延遲、分子振幅的差異都會改變電路的精度、召回率及假陽性率, 進而影響合成感應電路的性能和質量[63]. 除了信道容量,其他參數, 如撥動開關、邏輯門等也經常用于表征通信系統性能的指標[63,65].

　　3 合成生物學針對QS的種內通訊調控線路

　　細菌的QS系統主要分為種內通訊和種間通訊兩大類, 目前對于種內通訊的研究主要集中在生物被膜形成、QS猝滅以及環境監測等方面, 在構建計算工具、調控種群密度和調節代謝流等方面也有部分涉及. 近年來, 合成生物學針對上述過程取得的重要進展, 主要包括撥動開關、生物傳感器和邏輯門等.

　　3.1 撥動開關

　　生物工程的主要目的是利用多基因重組技術來提高目標產物的產量, 傳統方式主要是基因敲除和過表達, 但這兩種方式可能會損害菌體的生長狀況[66,67].撥動開關是解決這一問題的有力工具, 它可以實現特定基因的適時激活和關閉, 可用于合成基因線路中提高目標產物的產量[68]. 最典型的例子是Gu等人[69]構建的aroK撥動開關, 它可以精準控制大腸桿菌莽草酸酯合成途徑中蛋白活性和關鍵酶的表達, 減少不必要的能量消耗, 最終使野生型大腸桿菌分泌莽草酸產量高達13.15 g/L, 成功構建了基于撥動開關的營養缺陷型合成莽草酸鹽的大腸桿菌工程菌株.

　　在此基礎上, 近年來通過撥動開關與QS系統相結合, 構建了諸多新的基因線路來實現細菌群體的種內通訊以實現特定的目的. Swofford等人[70]構建了lux QS系統和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)報告基因耦合開關,并將其整合到非致病性沙門氏菌中, 通過對小鼠體內的定位發現新構建的開關能作為一種生物標記(biomarker)對腫瘤進行靶向治療. Soma和Hanai[71]在大腸桿菌中構建了一個捆綁lux系統和代謝撥動開關(metabolic toggle switch)調節器, 利用該調節器可實現代謝流從三羧酸循環到異丙醇生產的重新定向, 大幅提高了異丙醇的產量. 此外, Gupta等人[72]設計了依托QS機制的pfk-1基因(參與糖酵解), 可根據發酵時間和細胞密度來確定基因開啟的最佳點. 當AHL不存在時以合成葡萄糖為主, 當AHL積累到一定閾值后會關閉pfk-1基因的表達, 啟動肌醇(myoinositol, MI)的產生.

　　近年來, 隨著研究的深入, 撥動開關的應用已從單一代謝路徑進入到了多重動態途徑. 其中, Doong等人[73]的研究最具代表性. 他們構建了涉及兩個動態調控的機制, 這種機制可實現分層調控, 獨立調節兩種不同酶的表達, 從而提高D-葡萄糖醛酸的產量. 在這種開關的調解下, 可實現細胞“生長模式”與“生產模式”的切換; 相應的, 其下游產物(MI和D-葡萄糖醛酸)也可以得到相應控制. 此外, 多重調控開關也在Cui等人[74]的研究中得到了進一步展示. 他們構建了基于兩個天然啟動子即PabrB和PspoiiA的雙功能模塊化系統.通過改變啟動子結合位點、數目和序列, 構建了一個具有上調和下調能力的啟動子庫. 然后, 將雙功能模塊化系統運用到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中進行甲萘醌-7(menaquinone-7)的生產, 通過該動態途徑調控后甲萘醌-7的產量提高了近40倍.

　　3.2 生物傳感器與撥動開關類似, 生物傳感器是另一種作為調節的元件應用于合成生物學研究QS系統的方式[77]. 最早的生物傳感器是核糖開關, 一種適體結構域和表達結構域的組合, 可以通過感應底物濃度來實現對基因表達的動態調節[78]. Pang等人[79]開發了一種N-乙酰神經氨酸(NeuAc)核糖開關, 利用該調節器可對一些途徑和關鍵酶進行優化, 如提高NeuAc的產量. 隨后,Raut等人[80]優化了基于哈維氏弧菌(V. harveyi)BB170菌株的AI-2型全細胞傳感系統. 當AI-2進入細胞后會與LuxP結合, 進而啟動LuxCDABE的轉錄, 促進熒光素酶及其底物的表達, 最終導致生物發光.

　　目前該系統可為炎癥性腸病早期的診斷提供便捷方法. Wen等人[81]構建了一種在無細胞蛋白表達系統中的模塊化DNA編碼傳感器, 它可以在納摩爾水平上定量檢測痰樣品中的QS信號分子3-oxo-C12-HSL, 提高囊性纖維化疾病的診斷速度. 此外, 光生物傳感器與基于蛋白酶的動態雙調控開關應用于大腸桿菌工業化生產, 其中光生物傳感器將核酸介導的信號放大, 得到基因表達量所對應的大腸桿菌密度范圍, 加上位點特異性DNA重組酶和細胞裂解酶建立起的兩個獨立系統, 對信號結果做出反饋.

　　這一策略解決了大腸桿菌在細胞工廠中存在的合成效率低的問題, 通過調節大腸桿菌細胞的C/D周期, 改變細胞的比表面積和細胞體積, 進而調控不同產物的生產強度和耐受性, 實現代謝流的精準分配[81].除了醫學診斷和細胞代謝工程, 生物傳感器在生態環保方面也提供了有力的幫助, 如汞污染. Cai等人[82]利用QS的正反饋系統與汞特異性操縱子MerR,構建了一種依賴Hg2+離子的可調MerR蛋白, 并在此基礎上組裝構建了對汞特異性的生物傳感器. 通過含MerR蛋白的汞特異性操縱子來控制LuxI的表達, 形成的LuxI-AHL復合物具備依次激活Prlux并表達RFP的能力. 將該方法擬合到經典的Hill方程, 研發出超靈敏的汞污染檢測探針. 此外, Thapa等人[83]利用光信號轉換為電信號的原理,

　　4 合成生物學針對QS的種間通訊調控線路

　　細菌在自然界中并非獨立存在, 它們之間相互影響, 不論是在大氣、海洋、土壤中, 還是在生物體內,既存在依附關系, 也存在競爭關系. 微生物多以混居共生的方式生存在一起, 彼此之間形成復雜的種群交互.因此, 細菌除了種內交流, 也通過種間交流的方式來啟動特定基因的表達, 從而控制整個群落的狀態, 提高整個群體的生存能力[87]. 合成生物學在種間調控中的行為主要包括: 密度控制、振蕩子和微生物的共培養等.

　　4.1 密度控制微生物生長環境中的營養物通常有限, 而且相對擁擠的環境也不利于微生物的生長[88,89]. 因此, 調控種群生物量對于提高產物得率具有重要意義. Wang等人[90]通過將糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和“雙歧分流”相結合, 在大腸桿菌中構建了一個EPbifido途徑. 將該途徑應用于PHB、甲羥戊酸和脂肪酸的生產, 可以很好地降低二氧化碳排放量并提高產物的摩爾轉化率.Patidar等人[91]以扁藻(Tetraselmis striata)和橄欖菌(Pelagibaca bermudensis)為研究對象, 采用階段共培養模式評估了不同脅迫條件下生物燃料的生產情況. 結果表明, 橄欖菌及其代謝物可以與扁藻相互促進, 從而提高脂質產量, 其主要原理是HHQ和PQS增加了橄欖菌的細胞豐度, 在生物表面形成生物膜, 放大了互惠互利的共生效應.

　　此外, Chen等人[92]使用兩種不同的QS系統構建了“激活”和“阻遏”菌株, 其中“激活”菌株(rhl系統)在rhl-AHL信號分子存在下可激活兩種菌株中目標基因的轉錄, 而“阻遏”菌株(cin系統)在cin-AHL信號分子存在下通過表達阻遏物LacI降低兩種菌株中靶基因的轉錄. 這種雙QS系統構建的共培養體系具有很強的適應性, 可成功地實現種群密度的動態調控.另外, 在種群之間調控機制的解析上, 一些生態學家嘗試通過構建一些小型的合成生態系統來進行探索. Scott等人[93]利用lux和rpa系統設計了以鼠傷寒沙門氏桿菌兩個菌株同步裂解為動態調控核心的共培養系統.

　　在該系統中, 兩個菌株分別攜帶lux和rpa系統,并表達對應的信號分子lux-AHL和rpa-AHL; 隨著共培養菌株密度的增長, 當兩個菌株中各自的AHL分子濃度達到一定的閾值時, 將分別激活對應的啟動子并促使細胞裂解蛋白X174的表達, 造成菌株裂解, 以達到調控種群密度的目的. Stephens等人[94]基于AI-2的誘導特性, 在大腸桿菌中構建了一種新型的雙菌, 即銅綠假單胞菌共培養系統, 并成功實現種群密度比例的動態調控以及預測. 該系統首先構建了一個能感應AI2并能將其轉化為正交QS信號AI-1的菌株; 產生的AI1信號可自由擴散進入第二菌株, 并激活PtsH蛋白表達, 借助葡萄糖轉運促進細胞生長, 通過動態控制第二菌株的生長速率來達到調節菌群比例的目的.

　　4.2 振蕩子在基因調控網絡中存在少量具有全局性行為的調控因子, 它們能夠調控多種代謝活動, 如種群生物量[95]、激素分泌和晝夜節律等[96,97], 這與基因的振蕩性有關, 所以構建合成基因振蕩器成為合成調控研究的方向之一. Prindle等人[98]將信號強卻僅適用短程傳輸的QS系統與信號弱卻適用遠程傳輸的氧化還原信號系統相結合, 利用過氧化氫氣體的快速傳播能力, 實現了更大范圍群體的同步周期性行為, 并提高了生活史的周期性精度. 基于新的系統, 該團隊還開發了一種砷元素感受器, 能精準地反應環境中砷的濃度, 并由上百個小菌落組成的陣列通過不同的振蕩頻率表現出來[98].

　　Chen等人[92]通過整合兩套QS體系, 構建了由激活型菌與抑制型菌組成的混合菌群, 使兩個不同基因組成的細菌群體在基因表達上產生相互依賴的同步振蕩. 此外, Prindle等人[98]通過整合振蕩器、群體間的氣相氧化還原信號和lux系統, 在不同的菌落間形成耦合的遺傳“生物混合體”. 當不含亞砷酸鹽時, ArsR會抑制luxR的表達, 從而無熒光和振蕩的產生. 但當亞砷酸鹽含量足夠時, 這種抑制作用會被解除, LuxR-AHL復合物將會促進熒光基因的表達和產生振蕩, 最終實現數千個振蕩群體在厘米尺度上的同步. 這些研究表明,QS系統和振蕩子模型相結合在調控微生物聯合體同步性方面具有很大潛力, 有利于代謝工程的實際應用,特別是開發和優化高價值代謝產物的生產途徑.

　　5 合成生物學基因電路的魯棒性

　　合成菌群是基于基因電路的設計策略而構建的,菌群的規模取決于微生物之間的互作, 動力學和穩定性的特征, 以及不同時間和空間的微生物群落的穩態協調等[103], 這需要很強的魯棒性. 基因線路在合成之后, 其魯棒性是后期實驗中重點考察的指標, 它決定了未來在合成基因線路和網絡功能表達的精準性和長期性, 這對設計和構建基因電路的原則和計算具有嚴格要求.細胞之間的競爭、拮抗和共生的關系, 受外界各種波動因素的影響, 這使得種群一直處于動態變化之中. 隨著時間、空間的推移和變換, 不同生態位的細菌種群發生基因組進化和水平基因轉移的概率升高[104]. 合成基因電路中的工程基因易產生變異, 因而在短時間內電路失去其特定的功能, 表現出一種“功能正常”的假象, 通過繼續利用體系中的底物而產生非理想化的表型[105,106]. 因此, 基因電路的魯棒性和穩定性是合成菌群必須考慮的參數, 并在整個合成菌群的生命周期對其進行測試. 有學者在延長基因電路的魯棒性和穩定性方面, 提出了降低宿主細胞的突變率和避免易突變設計的策略, 并強調了宿主細胞電路元件的魯棒性策略[106].目前, 對于已知的QS串擾和干擾, 電路的魯棒性源自兩方面.

　　一方面, 由于合成群落的細胞平均分擔來自輸入端的化學信號, 當接收到變化的信號時可有效地離散化, 錯誤電路因此終止, 減少細胞突變的影響; 另外一方面, 電路發生到被檢測到, 存在時間上的延遲,借助遺傳編程的邏輯門和化學線路的細胞魯棒性對其進行計算, 不僅可以提高種群對電路各級反應的響應,也增強系統對出錯和抗干擾影響的能力[67]. 化學信號結合這種細胞間的離散化, 是合成生物學電路設計的一種方法和原則, 旨在克服各級層電路觸發的隨機性,而時間和空間上的協調, 則需對遺傳程序的設計, 對實現遺傳表達時間的異步計算, 這種計算操作有助于設計和構建具有魯棒性和穩定性的基因電路[107].然而,由于自然界中微生物存在混雜的QS串擾及其影響, 這在計算和測試中不易被預知, 串擾對基因的調控和細胞表型會產生什么影響, 也會帶給設計電路一些無法規避的知識盲區. 因此, 未來的研究中需要各學科的交叉和融合, 以開發更多新的策略用于深入研究.6 合成生物學調控QS的應用基于目前對細菌QS系統機制的認識, 合成生物學設計可靠的遺傳電路, 調控QS過程和細菌的基因表達,賦予工程菌群新的生物功能[108,109]. 這一策略已用于疾病治療、環境治理和海洋生態保護等.

　　6.1 疾病治療改變細胞-細胞間的通訊系統, 開發新型抗生素是合成生物學用于疾病領域的早期嘗試[110]. 一些植物提取物可以誘發群體淬滅, 降低AI-2和AHL活性并最終阻止毒力基因的表達[111]. 海洋藻類中開發的呋喃酮和QS裂解酶是最典型的群體淬滅劑. 其他來源的淬滅劑也相繼被發現, 如環硫化合物(cyclic sulfur compounds)、青霉素酸(penicillin acid)等, 這些化合物都能抑制QS自誘導劑AHL的產生, 以阻斷QS通路, 進而影響毒力基因的轉錄和表達[112,113]. 此外, 近期針對SAM抑制劑的研究也在積極地探索中, 因為它是自誘導劑AHLs和AI-2合成的輔助因子[114]. 破壞了輔助因子的生成, 也就降低了下游信號分子合成的概率.在實際醫學應用中, 針對LuxI/LuxR應用合成生物學控制大腸桿菌的數量是早期例子之一.

　　You等人[115]在大腸桿菌中設計了利用費氏弧菌來源的LuxI/LuxR調控細胞凋亡來控制群體數量的基因線路, 他們將細胞凋亡基因ccdB置于LuxR結合的PLuxI啟動子控制下.當環境中信號分子AHL達到閾值時, LuxR與AHL結合,啟動ccdB 基因的轉錄, 從而引起程序性死亡, 通過該方法可對病原菌生物量進行很好地控制. Hong等人[116]基于對生物被膜信號通路的研究, 通過控制枯草芽孢桿菌信號分子的表達, 設計出一種工程生物被膜,這種新型被膜可以分泌多種抗菌肽來抑制硫酸鹽細菌(sulfate-reducing bacterium, SRB)的生長, 從而降低該菌的侵蝕作用.

　　類似的方法也應用于其他細菌中, 將結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的INV基因(編碼侵襲素)和費氏弧菌的LuxI-R功能模塊共同導入大腸桿菌中, 使其能夠在選擇性條件下具有癌細胞侵入能力, 從而找到殺滅癌細胞的新方法[117]. Hwang等人[118]研發了一種編碼抗生物被膜的基因合成遺傳系統, 使大腸桿菌合成綠膿桿菌素裂解銅綠假單胞菌, 抑制其生物被膜的形成, 用于預防腸道感染. 近期的研究中進一步拓展了研究的深度. Sedlmayer等人[119]基于合成生物學原理, 提出了通過閉環式調控QS過程從而減輕銅綠假單胞菌對人體毒性的設想. 在隨后的研究中[120], 他們成功構建了一個既能降低白色念珠菌毒性, 又不會造成合成遺傳通路障礙的系統.

　　上述研究中的核心實驗是利用哺乳動物細胞上的甲酰肽傳感器感應多種細菌分泌的甲酰多肽, 進而強化AI-2信號傳遞的QS效應, 抑制白色念珠菌生物被膜的形成[120]. 該研究驗證了細胞通過合成生物學可將其設計為病原菌自動識別和“防御衛士”的這一猜想.基因編輯工具的出現也助推了生物醫學領域的應用. 有研究者提出通過合成生物學方法對CRISPR-Cas免疫系統進行調控的設想[121]. 生態模型的初步研究結果顯示, 如果將合成生物學與基因組編輯相結合, 設計疾病相關的遺傳電路以強化免疫系統, 便可促進人體免疫細胞對病原菌的抵抗力; 同時, 也可反向思維對QS系統進行破壞, 抑制其生物被膜的發育, 從而降低銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、類鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的感染率[121]. 以此為背景, 通過合成生物學編輯益生菌, 改造免疫幫手的御敵能力抑或是未來診斷和治療疾病的新趨勢.

　　7 總結與展望

　　現代分子生物學、代謝工程和基因組學在QS領域的廣泛應用, 推進了對微生物群體未知領域的探索.目前已知的QS信號通路和網絡, 在預防疾病、生態修復和海洋抗生物污損方面得到了較為深入的應用. 考慮到生態、環境以及醫學等領域邊界廣、尺度大等現狀, 仍存在許多問題亟待解決. 這些問題的克服需要開發更加先進的技術, 以及發展生物、化學、數學和計算方法, 從個體和系統層次來集成和系統操作.未來需要考慮和可以嘗試的方向如下。

　　(1) 合成方法的抗干擾性. 細菌個體極易受生物和非生物因素的影響, 如何確定合成菌群表型和突發行為發生的概率, 構建更為成熟的可預測菌群動態變化的群落模型是今后亟待加強的方向之一.(2) 合成應用的環境真實性. 由于實驗室條件無法真實反映微生物生態系統的復雜性. 因此, 基因設計的底盤細菌開發尤為重要, 這不僅可以滿足未來合成生物學設計遺傳電路和復雜群落的需求, 也有望將其從實驗室轉移到自然生態系統中應用. 機器學習、生物信息和基因編輯技術的有效輔助, 可使合成生物學對遺傳電路實現更為精準、模塊化的設計, 從而構建人工智能化調控的個性化功能生物網絡.(3) 合成生物學聚焦目標的拓展. QS信號的應用研究目前大多數主要是針對AI-1信號通路的設計, 而對AI-2和AIP的研究較少. 而一些非常見環境或極端環境(深海、深地、深空), 新型真菌、細菌和古菌均有待深挖. 這些微生物具有AI-2和AIP的能力, 針對這兩種QS系統進行合成生物學的改造, 并用于工程系統的設計和構建, 從而使QS的應用得到延伸.

　　(4) 應用生境的衍生. 針對較少記錄的特殊生境,如極地、熱液、冷泉、臨近空間等極端環境, 有望挖掘到一些新的機制, 例如環境適應機制(耐壓、耐熱、嗜冷、抗紫外線等), 新型物質代謝機制(化能途徑)以及協同進化過程等.(5) “分子編程”的應用. 為了提高目標產物的得率,需要對影響QS系統的各種因素進行深入分析, 輔以數學模型為微生物生長過程進行“編程”. 將其長時間維持在所需要的濃度, 通過延長穩定期、指數期以便更有效地控制發酵過程, 使微生物始終處于最佳工作狀態. 對微生物的各種代謝途徑進行精準“編程”, 構建更高效的“恒化器”或“恒濁器”, 使它們能像工業化設備一樣生產人們所需的各種產品.

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　　作者：徐梅婷1,2, 程珂珂1, 曾艷華1, 周進1*, 陳國福3